ZIC5及KLF5在结肠癌的表达与临床特征和预后的关系*

冷 玥，张 涛,赵津璋,刘 洋，王柏欣△

(1.佳木斯大学，黑龙江佳木斯 154000；2.北京市石景山医院肿瘤科，北京 100042)

结直肠癌是一种临床常见恶性肿瘤，我国结直肠癌发病率和病死率在近年来一直呈上升趋势，给人民健康和生活质量造成严重威胁[1]。已有研究报道表明结直肠癌的发生、进展、转移等过程是由多种因素共同造成的病理过程，多种基因、信号通路及蛋白质在其中发挥重要的作用[2]。小脑锌指结构(zinc finger protein of the cerebellum，ZIC)家族包括ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5，各自编码锌指转录因子，组成5个Cys2His锌指结构域[3]。越来越多的研究显示，ZIC5蛋白参与前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的发生、发展[4-6]。Krüppel样因子5(Krüppel like factor 5，KLF5)是人体内重要的转录调控因子，与肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移有密切关系[7]。既往有关结直肠癌组织ZIC5和KLF5蛋白表达的研究报道较少且研究结论不一致，本研究采用免疫组织化学法和Western blot检测结直肠癌组织ZIC5和KLF5表达水平，分析其与患者病理特征相关性并初步探讨其对预后的判断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月至2017年8月北京市石景山医院收治的74例结直肠癌患者的血液标本和结直肠癌组织、癌旁组织(距离肿瘤组织外缘>5 cm)作为研究材料。纳入标准：(1)经手术切除组织病理学检查诊断为结直肠癌；(2)术前未接受放疗、化疗、靶向治疗或免疫治疗；(3)临床和随访资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)既往有结直肠手术史者；(3)临床资料不完整者；(4)失访或因结直肠癌以外原因死亡者。本研究通过医院医学伦理委员会审核，所有患者对本研究均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学

本研究中所有的组织石蜡切片均由北京市石景山医院病理科切片制备，厚度4 μm。研究采用S-P免疫组织化学法检测结直肠癌组织和癌旁组织ZIC5和KLF5蛋白的表达情况，实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。阴性和阳性对照分别为磷酸盐缓冲液和已知的ZIC5和KLF5阳性标本。ZIC5主要定位于细胞质，同时在细胞核中也有少量表达；KLF5主要表达在细胞质和细胞核中，以特定部位出现淡黄色至棕褐色判断为阳性。以染色强度和视野内阳性细胞百分比综合评判ZIC5和KLF5蛋白表达强度。(1)染色强度：0分，无着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。(2)阳性细胞百分比：0分，未见阳性细胞；1分，阳性细胞百分比<10%；2分，阳性细胞百分比10%～<50%；3分，阳性细胞百分比50%～<75%；4分，阳性细胞百分比≥75%。染色强度和阳性细胞百分比评分乘积作为最后结果，其中0分为阴性，1～3分为低表达，>3分为高表达。本研究所使用的S-P免疫组织化学法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人ZIC5抗体和鼠抗人KLF5抗体购自美国Abcam公司。

1.2.2Western blot

第1步，取石蜡切片脱水后称取50 mg组织，冰浴研磨后超声破碎，于4 ℃，18 000 r/min离心30 min，取上清液。第2步，采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。第3步，取50 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素膜上。第4步，TBST缓冲液洗膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗(ZIC5和KLF5一抗稀释度均为1∶15 000)，4 ℃冰箱孵育过夜。第5步，TBST洗膜30 min，1∶1 000二抗孵育2 h后加入碱性磷酸酶底物，显色液显色。第6步，使用UPV扫描仪进行扫描，ZIC5蛋白分子量为66×103，KLF5蛋白分子量为52×103，以β-actin为内参。

1.2.3随访

对患者进行随访，末次随访时间为2021年4月，记录无病生存期(disease-free survival，DFS)和总生存期(overall survival，OS)。

1.3 统计学处理

采用SPSS26.0软件进行数据分析，不符合正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，比较采用秩和检验；计数资料以频数或百分率表示，比较采用χ2检验；等级资料组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用Kaplan-Meier法制作生存曲线并进行Log-Rank比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学结果

与癌旁组织比较，结直肠癌组织ZIC5和KLF5的阳性率及高表达率更高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

A.ZIC5在结直肠癌组织表达阳性；B.ZIC5在癌旁组织表达阴性；C.KLF5在结直肠癌组织表达阳性；D.KLF5在癌旁组织表达阴性。

表1 ZIC5和KLF5在结直肠癌组织和癌旁组织的表达情况[n=74,n(%)]

2.2 Western blot结果

结直肠癌组织ZIC5和KLF5表达强度高于癌旁组织，见图2。

图2 Western blot检测组织ZIC5和KLF5蛋白的表达水平

2.3 结直肠癌组织ZIC5和KLF5表达与病理特征关系

结直肠癌组织ZIC5的表达情况与肿瘤分化程度、Duke’s分期、浸润深度和淋巴结转移有相关性，KLF5表达情况与肿瘤分化程度、Duke’s分期和浸润深度有相关性(P<0.05)，见表2。

表2 结直肠癌组织ZIC5和KLF5蛋白表达与病理特征关系(n)

2.4 结直肠癌组织ZIC5和KLF5表达水平与患者预后关系

ZIC5和KLF5蛋白阴性的结直肠癌患者的DFS、OS长于阳性患者(P<0.05)，见表3，图3。

图3 DFS和OS生存曲线比较

表3 ZIC5和KLF5表达与结直肠癌患者DFS、 OS关系分析[M(Q1,Q3)，月]

3 讨 论

随着世界医疗水平的不断完善，人类的平均寿命得以延长，但恶性肿瘤的发病率却随之不断攀升，其中结直肠癌已经成为影响人类生命健康的重要疾病之一。我国结直肠癌发病率和病死率较高，这与我国居民健康和体检筛查意识较弱及结直肠癌临床症状不特异有关[8-9]，成为限制结直肠癌预后的因素。近年来，随着肠镜和分子生物学等技术的进步和深入应用，结直肠癌的检出率明显提高，然而大多数患者在确诊时已经为中晚期[10-11]。因此，有必要对结直肠癌的发病、进展及预后影响因素和机制进行深入研究，探索结直肠癌的诊断、预后评估新指标，治疗新靶点，为改善结直肠癌患者整体预后提供新的思路和方向。

当前外周血血清中癌胚抗原、癌抗原(CA)125、CA199等肿瘤标志物对结肠癌患者手术根治后随访和评估的价值已得到广泛认可[12-13]。然而，受限于上述血清标志物的灵敏度及特异度较低[14]，仍然有部分结肠癌复发病例术后血清学未能检测出上述标志物的升高,从而延误术后复查影响远期生存，急需新的预后标志物早期识别术后复发高危人群以进行术后分层管理。通过文献检索发现，目前已有大量研究发现ZIC5在前列腺癌、肺癌和胶质瘤等多种恶性肿瘤中呈高表达状态[15-16]，同时杨丽等[17]研究证实ZIC5在肝癌中的表达水平升高且与疾病进展及肝硬化有相关性，但MA等[18]通过研究发现胃癌与ZIC1相关，但与ZIC5无关，这说明ZIC5的表达存在着组织特异性。目前已掌握的研究认为ZIC5可能通过以下几个机制在肿瘤的发生和进展过程中发挥作用：(1)ZIC5通过血小板源性生长因子D(PDGFD)激活FAK和STAT3，从而促进肿瘤增殖和侵袭[19]；(2)ZIC5能够调节Wnt-β-catentin信号通路进而促进肿瘤增殖、侵袭和迁移[20]；(3)ZIC5蛋白抑制CCNB1基因的表达并促进Ki67基因表达，从而促进肿瘤进展[5]。在本次研究中，经过研究人员对比分析结直肠癌组织ZIC5的阳性率和高表达率均明显高于癌旁组织，ZIC5表达情况与肿瘤分化程度、Duke’s分期、浸润深度和淋巴结转移具有明显关系，ZIC5蛋白阴性表达的结直肠癌患者预后明显优于阳性表达患者。

KLF5能够促进细胞的正常生长与分化，目前对于KLF5在肿瘤中的功能已有广泛研究，通过文献调研显示KLF5在不同肿瘤中的作用不同，如在乳腺癌中KLF5能够促进肿瘤进展和侵袭[21]，而在食管癌中KLF5则表现为抑癌基因的特点[22]。在本研究中，结直肠癌组织KLF5的阳性表达率和高表达率均明显高于癌旁组织。KLF5的表达情况与肿瘤分化程度、Duke’s分期、浸润深度和淋巴结转移有明显关系，KLF5蛋白阴性表达的结直肠癌患者的OS和DFS明显长于阳性表达患者。王文韬等[23]研究中也发现结直肠癌肿瘤组织KLF5蛋白呈高表达，且与肿瘤的浸润深度、临床分期、淋巴结转移等病理特征有关，其还认为KLF5蛋白可能通过调节金属基质蛋白酶(MMP)-2、MMP-9而促进肿瘤侵袭转移。

综上所述，结直肠癌组织ZIC5和KLF5的表达增强，与肿瘤的分化程度、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移等病理学特征相关，ZIC5和KLF5或可作为结直肠癌患者的预后标志物及潜在的治疗靶点，但具体机制有待深入研究。