响应面法优化聚酰胺层析纯化烟草绿原酸的工艺研究

陈月星，李亚文，张梅娟

(商洛学院，陕西 商洛 726000)

烟草种植与加工在我国经济发展中发挥着重要作用[1-2]，基于废次烟草的循环利用和绿原酸产业需求，拟采用响应面法，对烟草绿原酸纯化工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

废次烟叶(商洛市烟草公司提供)。

1.2 试剂

95%乙醇、乙酸、氢氧化钠、纤维素酶(食品级)、绿原酸标准品、乙腈、无水甲醇、聚酰胺树脂。

1.3 仪器与设备

电子分析天平(BS110)、电热鼓风干燥箱(DHG-9030A)、恒温水浴锅(HH-4)、微型粉碎机(FW80)、pH 计(PHS-3C)、旋转蒸发器(RE52-99)、真空抽滤机(CM- 2002)、高效液相色谱仪(TDP-009)。

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理

参照李亚男等[3]的方法进行绿原酸粗品提取。

1.4.2 聚酰胺层析法对烟草绿原酸纯化工艺流程

取100 mL绿原酸粗品倾入装有预处理好的聚酰胺树脂层析柱→乙醇洗脱→真空干燥得到绿原酸纯品→聚酰胺回收再生。

1.4.3 高效液相色谱法测定绿原酸方法的建立

样品溶液的制备。准确称取一定量的绿原酸粗品置入25 mL容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解定容至刻度，充分混合后经滤膜过滤后待测。

色谱条件。HPLC检测条件：流动相A为0.5%的乙酸水溶液，流动相B为乙腈，柱温为35℃，柱流量为1 mL/min，进样体积为20 μL，梯度洗脱为0～10 min A90%、B10%，10～15 min A59%、B41%，15～20 min A90%、B10%，检测波长为327 nm。色谱柱型号及参数为ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。

标准曲线的建立。精确称取10 mg/mL绿原酸标准溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分别置于25 mL容量瓶用甲醇定容到刻度。用高效液相色谱仪检测稀释液峰面积，以绿原酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以此来绘制标准曲线。

1.4.4 聚酰胺柱层析法纯化绿原酸单因素实验

聚酰胺柱层析基准工艺：用30 mL浓度为8 mg/mL的吸附液上80～100目聚酰胺柱(16×300 mm)进行动态吸附，用2.5 BV 45%的乙醇来进行洗脱，分段收集洗脱液，测定不同洗脱液浓度中的绿原酸含量，计算解吸附率。

在以上工艺基础上，对上柱液浓度、洗脱液浓度和用量(BV)进行单因素实验，因素及水平如表1所示。

表1 单因素及其水平表Tab.1 Single factors and their levels

1.4.5 响应面优化实验设计

在单因素实验基础上，利用Design Expert 8.0.6软件、Box-Behnken法设计响应面优化试验，获得聚酰胺层析法纯化烟草绿原酸的最优工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以绿原酸浓度为横坐标，相对峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(见图1)，回归方程为y=154.99x-2.329 8，R2=0.999 9，表明绿原酸在0.2～1 mg/mL范围内线性关系良好。

图1 绿原酸标准曲线Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.2 单因素实验

经分析，各因素最佳水平分别为：上柱液浓度为8 mg/mL、洗脱液浓度60%和洗脱液体积2.5 BV，因此确定上样液浓度6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，洗脱液浓度50%、60%和70%，洗脱液体积1.5 BV、2.5 BV和3.5 BV进行响应面优化。

2.3 响应面实验优化

2.3.1 响应面实验结果

响应面实验结果如表2所示，其中A0B0C0组合解析率最高为92.97%。

表2 Box-Behnken试验方案及结果Tab.2 Box-Behnken test protocol and results

2.3.2 响应面回归模型分析

建立以上柱液浓度X1、洗脱液浓度X2、洗脱液体积X3为自变量，解吸附率 Y为因变量的回归模型，回归方程

Y=91.55+1.48X1+1.68X2+2.3X3+0.78X1X2+2.02X1X3-2.59X2X3-10.2X12-8.38X22-5.79X32

由表3可以得到，F值为61.2，P值<0.000 1的模型，表明该模型具有高度的显著性。决定系数R2=0.994 3，表明模型的预测值与实际值吻合度极高，可以解释99.43%的响应值变化，R2=0.997 5有合理的一致性，失拟相P值0.736 2>0.05，不显著，说明该二次方程与真实响应面拟合度较高，模型成立。回归模型中C、BC、A2、B2、C2都达到影响极显著(P<0.01)，A、B、AC影响显著(P<0.05)，说明各个影响因素对解吸附率具有显著的影响。变异系数C.V%值为1.61，比较稳定。说明可以使用该模型对烟草绿原酸的纯化工艺优化做出合理的分析和评估。

表3 回归模型统计结果Tab.3 Statistical results of regression model

各个单因素对解吸附率的影响从大到小依次为C(洗脱液用量)>B(洗脱液浓度)>A(上柱液浓度值)，AB交互作用不显著，AC、BC交互作用分别达到显著和极显著水平。

2.3.3 工艺参数优化结果

根据响应面模型的分析，得到最佳纯化工艺参数为上柱液浓度为8.13 mg/mL，洗脱液浓度为61.49%的乙醇，用量为2.71 BV。此条件下，解吸附率为91.52%。

2.3.4 最佳工艺参数结果验证

因响应面优化结果得到的绿原酸解吸附率为91.52%，低于响应面试验组合A0B0C0，故以响应面优化结果工艺(W1)、A0B0C0工艺(W2)进行验证实验，为了方便实验，将响应面优化结果整合为上柱液浓度为8.1 mg/mL，洗脱液浓度为61%，用量为2.7 BV，实验结果如表4所示。

表4 验证实验结果分析Tab.4 Analysis of confirmatory experiment results

由表4可知，W1比W2平均解吸附率较高，因此最佳纯化工艺参数为上柱液浓度8.1 mg/mL，洗脱液浓度61%，用量2.7 BV。

3 结论与讨论

以废次的烟叶为研究对象，采用聚酰胺柱层析法对烟草绿原酸提取液进行纯化工艺研究，在单因素实验基础上，利用响应面法进行优化，最终确定优化工艺为上柱液浓度8.1 mg/mL，洗脱液浓度61%，用量2.7 BV，此条件下，解吸附率为91.9%。但是，聚酰胺层析法纯化烟草绿原酸，在提高绿原酸纯度的同时存在高成本、高耗时等问题，因此对于如何降低废次烟叶中高纯度绿原酸提取成本的问题将是下一步的研究重点。