褪黑素预处理对桃耐涝性的调控效应

古咸彬，陆玲鸿，宋根华，肖金平，张慧琴

(浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021)

水分是影响作物生长发育、产量、品质形成的主要因素，土壤水分过多导致根系受涝渍胁迫，水分缺乏导致植株受干旱影响。桃(L. Batsch)是我国第四大果品，味美多汁，营养丰富，深受消费者喜爱。桃根系浅，需水量大，但怕涝害。涝害导致土壤溶氧量下降，根系供氧困难，造成生理障碍，影响生长发育和果实品质。我国南方雨量充沛，桃生长期降雨次数多、强度大，尤其近年来极端天气频繁出现，雨量分布极不均匀，经常发生大面积、不同程度的涝害，造成桃产业严重的经济损失。目前，涝害已成为我国南方桃产区产业发展的主要制约因素。为应对涝害胁迫，培育耐涝砧木是较为有效的策略，但果树育种周期较长，抗逆性评价较为复杂，育种难度较大。植物涝害响应机制的研究结果表明，抗氧化酶活性强度、活性氧清除能力、渗透调节物质含量、内源激素水平等直接影响植物耐涝性。因此，通过外源物质改善相关耐涝指标，可作为应对涝害的应急策略。外源物质如细胞分裂素(6-BA)、尿素、γ-氨基丁酸(GABA)、茉莉酸甲酯、NO、Ca等可通过提高保护酶活性、保护光合系统等提高植物耐涝性。

褪黑素(melatonin，MT)是一种多功能的植物生长调节剂，参与调控植物的发育阶段，包括种子萌发、器官发育、光合作用、叶片衰老、品质形成等。褪黑素由色氨酸经4步酶促反应生成，包括色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)、色胺-5-羟化酶(tryptamine 5-hydroxylase，T5H)、5-羟色胺--乙酰基转移酶(serotonin-acetyltransferase，SNAT)、-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶(-acetylserotonin methyltransferase，ASMT)，、5、、基因分别编码以上蛋白质，调控褪黑素的合成。此外，褪黑素通过缓解氧化胁迫、抑制渗透胁迫、促进抗氧化酶活性等调控植物应对盐害、干旱、高温、低温、重金属等胁迫，并参与非生物胁迫相关的干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein，DREB)、热休克转录因子(heat shock transcription factor，HSF)、脱落酸(abscisic acid，ABA)等调控途径影响植物抗逆性。褪黑素能调节植物耐涝性。Zheng等发现，褪黑素通过维持有氧呼吸、保持光合作用和减少氧化损伤缓解涝渍对苹果种苗的损伤。叶面喷施100 μmol·L褪黑素能缓解淹水胁迫对高粱幼苗光合作用和抗氧化代谢的影响。涝害过程中，褪黑素能提高桃抗氧化酶活性，并有效减少植株膜脂过氧化反应，但存在一定剂量效应，200 μmol·L效果最佳。利用褪黑素提高植物抗逆性在生产中具有重要的应用潜力。

桃抗逆性种质的选育进展缓慢，环境胁迫具有偶发性和多发性，探索外源物质提高桃抗逆性的研究尤为重要。目前，关于褪黑素调节桃耐涝性的研究较少，褪黑素在桃抗逆性方面的应用尚缺少理论依据。因此，本研究以桃幼苗为试验材料，以前期试验筛选出的适宜浓度200 μmol·L褪黑素对材料进行预处理和淹水处理，结合转录组测序，研究外源褪黑素对提高桃耐涝性的调控机制，旨在明确褪黑素预处理缓解涝害胁迫的作用效应，以期充实褪黑素的生理功能，促进其在农业或相关领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

以桃(L. Batsch)实生苗为试验材料，于2020年9月在浙江省农业科学院园艺研究所进行。桃种子浸泡后去除种皮，置于湿润滤纸上催芽，有真叶发生时将其种植于经高压灭菌后的基质中，基质为泥炭、蛭石和珍珠岩以体积比9∶3∶1混合。于光照培养箱中培养，光周期为16 h光照/8 h黑暗，温度为光照25 ℃/黑暗20 ℃，相对湿度70%～80%，光照强度为10 000 lx。

用少量无水乙醇溶解褪黑素粉末(Sigma，分析纯)，再用纯水定容至200 μmol·L。

1.2 处理

苗长至八叶一心时，选择长势一致的植株分为2组，分别施加0和200 μmol·L褪黑素进行预培养。将溶液分别浇灌到各组基质中，盆底有溶液流出为止，每天浇灌1次，预培养5 d。预培养结束后进行淹水处理，水面保持高于基质2～3 cm，正常肥水管理作为对照。预培养与淹水处理均在培养箱中进行，环境条件与苗期培养相同。处理24 h后，洗净植株，取嫩叶和根，用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中。以上4组处理分别标记为CK(正常浇水)、W24(淹水处理24 h)、MT(200 μmol·L褪黑素预处理后正常浇水)、MT_W24(200 μmol·L褪黑素预处理后淹水处理24 h)。每个处理各6株植株，试验重复3次。

1.3 生理指标测定

使用SPAD-502便携式叶绿素测定仪测定相对叶绿素含量，选择植株顶端完全展开的3片叶子进行测定。

测定叶片相对含水量时将叶片分为2份，首先称量叶片鲜重，然后将其中1份烘干至恒重，称量干重，将另1份浸泡在蒸馏水中，当质量不变时称量叶片的饱和鲜重，相对含水量(%)=(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)×100。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力，以鲜重计算。

测定叶片相对电导率时将叶片置于装有10 mL ddHO的玻璃管中，室温下摇晃12 h，利用DDSJ-308A电导率仪测定水溶液的初始电导率()，将玻璃管置于沸水中水浴20 min，冷却到室温后，再次测定水溶液的电导率()，相对电导率(%)=(/)×100。

1.4 RNA提取与cDNA文库构建与测序

桃根系总RNA的提取利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)。1%琼脂糖凝胶检测RNA完整性，并利用BioDrop超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度，检测合格的各样品RNA送往深圳华大基因进行cDNA文库构建和测序工作。

1.5 数据处理与基因表达量分析

序列已提交至NCBI数据库SRA BioProject (PRJNA782223)，对测序得到的原始数据进行去冗余处理，得到有效序列(clean reads)，使用比对软件 SOAPaligner/soap2将clean reads比对到桃参考基因组(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Ppersica)。利用唯一比对的reads数目和比对上参考序列的总reads数目计算基因表达量。基因表达量的计算使用FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)法，然后将2个样品的基因表达量进行卡方检验。通过多重假设检验对值进行校正，校正后取≤0.01并且样品间FPKM比值(Foldchange)≥1的基因为差异表达基因(differential expression genes， DEGs)。

基于差异基因的功能注释，对所有差异表达基因进行GO (gene ontology)功能显著性富集分析。将所有的DEGs比对到GO数据库中(http：//www.geneontology.org/)，将它们区分为：Molecular Function、Cellular Component、Biological Process。使用R软件中的phyper函数进行富集分析，对-value进行FDR校正，通常-value≤0.05的功能视为显著富集。通过GO数据库对差异基因进行分类，可确定相关基因参与的生物学进程与相关功能。

在生物体内，各基因之间是相互作用的，相互协调以完成相关生物学进程，基于Pathway的分析能有效地帮助理解生物学功能。KEGG数据库(http：//www.genome.jp/kegg/)包含了大部分的Pathway信息，可用于分析基因主要参与的调控通路。同样应用超几何计算检验，找出与参考基因组相比在差异表达基因中显著富集的Pathway。定义-value≤0.05为显著富集的通路。

1.6 生物信息学分析

利用转录因子数据库PlantTFDB (http：//planttfdb.gao-lab.org/)信息，下载拟南芥和桃相关转录因子数据。利用ClusterW在默认设置下对转录因子家族成员氨基酸序列进行同源性分析。利用MEGA6.0软件中的NJ法构建系统进化树。利用TBtools进行启动子分析并可视化，以及表达热图分析。

1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证

通过差异表达基因分析筛选与涝害相关的基因并进行qRT-PCR分析验证。根据桃基因组数据库信息(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Ppersica)获取基因CDS序列。利用Beacon Designer 7软件设计引物，见表1。qRT-PCR采用SuperReal彩色荧光定量预混试剂盒(TIANGEN，北京)，反应体系：2×SuperReal Color PreMix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L)各0.6 μL，cDNA 2 μL (10 ng)，RNase-free ddHO 6.8 μL。

表1 荧光定量PCR引物

在LightCycler 96荧光定量PCR系统(Roche，巴塞尔，瑞士)进行反应，反应条件为：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s，60 ℃，32 s，循环40次。以为内参，采用2-ΔΔC法，以对照组为参考进行归一化处理，计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对涝害胁迫下桃生理指标的影响

200 μmol·L褪黑素预处理后桃的相对叶绿素含量、相对含水量、相对电导率与根系活力与对照相比无显著差异(图1)。预培养后再进行24 h淹水处理，植株的生长受到一定影响，相对叶绿素含量显著下降，褪黑素预处理植株同样下降明显。24 h淹水处理对叶片相对含水量影响不显著，4组植株的相对含水量几乎无差别。淹水使叶片和根系受到一定损伤，细胞膜透性增加，相对电导率显著上升，根系活力显著下降。褪黑素预处理后再淹水，相对电导率显著上升，但显著低于没有预处理的植株，根系活力也显著高于没有预处理的植株，说明褪黑素对叶片细胞膜和根系有保护作用。

利用SPSS Statistics 17.0软件进行显著性差异分析，One-way ANOVA用于显著性检验，Duncan法进行多重比较。柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。SPSS Statistics 17.0 software was used for significant difference analysis， one-way ANOVA was used for significance test， Duncan method was used for multiple comparison. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.图1 淹水处理后桃生理指标的变化Fig.1 Physiological indexes changes of peach after waterlogging treatment

2.2 差异表达基因统计

淹水处理结束后进行桃根系转录组测序分析。褪黑素预处理与对照相比，有495个基因显著上调表达，93个基因显著下调表达；直接淹水与对照植株相比，3 428个基因显著上调表达，3 946个基因下调表达(图2)，下调表达基因数量明显多于上调基因数量，说明淹水处理对桃整体机能有抑制作用。褪黑素预处理后进行淹水的植株，3 318个基因上调表达，3 928个基因下调表达，上下调基因数量接近直接淹水组。淹水条件下，褪黑素预处理未对涝害响应基因的数量造成影响。

图2 组间差异表达基因的统计分析Fig.2 Number statistics of differentially expressed genes in groups

2.3 褪黑素调控的基因分析

差异基因的GO富集分析显示，褪黑素预处理后最显著富集的term为“microtubule”微管运动和微管组织变化，说明褪黑素对根系的形态建成具有一定促进作用；与微管关联之后是氧化还原活性“oxidoreductase activity”(图3-A)，这类基因与胁迫应答密切相关。进一步分析氧化还原活性相关的基因，65个差异表达基因中55个基因在褪黑素预处理后显著上调表达，包括(漆酶)、(锌指蛋白)、(氧化酶)、(过氧化物酶)等胁迫相关基因(图3-B)，推测褪黑素激活这些基因的表达，有助于植物的应激反应。

A，GO富集分析；B，差异基因的表达热图。A， GO enrichment analysis； B， Heat map of differential gene expression.图3 褪黑素诱导富集的GO通路Fig.3 Enrichment of the GO items induced by melatonin

2.4 共同差异表达基因富集分类分析

淹水处理后，0和200 μmol·L褪黑素预处理的两组样品共同差异表达的7 156个基因(图4-A)在-value<0.05的前提下，富集到多个GOterm中。图4-B所示为富集气泡图，从3个维度展示富集程度，默认以value最小的前20个GO Term。最显著富集的GO term为分子功能分类中的“DNA-binding transcription factor activity”，该途径多为转录因子，通过结合目的基因启动子区域的特定顺式作用元件从而调控基因的表达，参与植物生长发育、响应环境胁迫等多个方面。该term中含有109个差异表达基因，其中90个基因显著上调表达(图4-C)，说明转录因子积极响应涝害胁迫，大部分为正向调控。其余富集的GO term包含分子功能分类中的泛素蛋白转移酶活性“ubiquitin-protein transferase activity”与转录调控活性“transcription regulator activity”，较显著的细胞组分分类为内质网“endoplasmic reticulum”和内膜系统“endomembrane system”。

A，组间比较Venn图；B，GO富集分析；C，差异基因的表达热图。A， Venn diagram between groups； B， GO enrichment analysis； C， Heat map of different expression gene.图4 共同差异表达基因的GO富集分析与表达热图分析Fig.4 GO enrich and expression analysis of common differentially expressed genes

上述显著富集的转录因子涉及14个家族，其中，AP2/ERF家族差异基因最多，达34个(表2)。AP2/ERF家族参与非生物胁迫如干旱、高温、低温、盐害等的应答调控，该家族在桃受涝害胁迫后差异表达基因最多，推测该家族与涝害应答有关。

表2 GO显著富集通路中差异表达的转录因子

AP2/ERF家族根据保守域的数量和结合元件类型分为5个亚族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist，差异基因分别有3、29、1、1、0个，进一步说明AP2/ERF家族的ERF亚家族在涝害应答中具有重要作用。桃和拟南芥ERF家族进化树分析如图5，对比拟南芥，桃ERF家族分为11个组，各组的差异表达基因比例差异明显，其中第Ⅶ组全部差异表达，第Ⅸ组差异表达的数量最多(表3)。图6为AP2/ERF家族34个差异基因的FPKM值，直接反应基因在各样品中的表达水平，部分基因虽然在组间差异倍数较高，但有可能实际表达水平较低。由图6可知，Prupe.8G264900在正常条件下表达水平较低，植株涝害处理后该基因显著上调表达；该基因属于ERF Ⅶ家族，结合前人关于ERFⅦ在涝害与低氧胁迫中的调控功能，预测Prupe.8G264900为桃涝害应答关键基因。

图5 桃和拟南芥ERF家族进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of ERF family in peach and Arabidopsis thaliana

表3 桃ERF转录因子家族成员差异表达基因分布

图6 差异表达的ERF成员的FPKM统计Fig.6 FPKM number of different expressed ERF family members

2.5 共同差异表达基因富集通路分析

-value≤0.05定义为差异基因显著富集的Pathway。KEGG富集气泡图如图7-A。糖酵解途径差异最显著，该途径是低氧条件下为机体提供能量的主要途径。该途径中45个基因差异表达，涉及糖酵解途径关键酶，如乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)等。相对表达水平如图7-B所示，大部分编码关键酶的基因上调表达明显，这些酶活性的高低直接反映机体抵抗低氧胁迫的能力。

A，KEGG富集气泡图；B，糖酵解途径与合成酶基因的表达热图；C，ERF靶基因预测。A， KEGG enrichment analysis； B， Expression heat map of glycolysis pathway genes； C， ERF target gene prediction.图7 KEGG富集分析及ERF靶基因预测Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis and ERF transcription factor target gene prediction

KEGG富集分析表明，糖酵解途径在涝害应答中有重要作用，这条途径中的关键酶受诱导表达。GO富集分析表明，ERF转录因子能响应涝害，推测ERF与糖酵解途径存在调控关系。结合桃基因组数据，提取糖酵解途径45个差异表达基因ATG上游2 000 bp序列进行启动子分析，通过PLANTCARE预测，发现6个差异基因启动子区含有能被ERF识别的顺式作用元件HRPE和GCC-box，元件可视化结果如图7-C。表明(磷酸果糖激酶)、(果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶)、(醛缩酶)、(磷酸甘油醛脱氢酶)、(乙醇脱氢酶)可能是ERF的靶基因。

2.6 荧光定量表达验证

为验证转录组数据的可靠性和有效性，同时检测相关基因对涝害的响应，利用qRT-PCR检测了8个基因的表达水平(图8)，包括Prupe.8G018100(1)、Prupe.1G234000()、Prupe.3G236200(41)、Prupe.1G305900()、Prupe.6G230600(7)、Prupe.8G264900(071)、Prupe.2G258200(15)和Prupe.2G272300(1)转录因子和功能基因。经褪黑素预处理后，所检测的基因均上调表达，涝害处理同样能提高相关基因的表达量，褪黑素预处理后再经涝害胁迫，大部分基因的表达量进一步升高，仅Prupe.2G258200 (15)和Prupe.2G272300(1)没有持续升高，但仍保持高水平表达，由此表明，相关基因与逆境相关，褪黑素对其具有诱导作用，在逆境发生后能强化应激能力，说明褪黑素对植株的耐受性获得有一定促进作用。将转录组测序的FPKM值与荧光定量结果进行比较分析，2种方法同为检测基因表达水平，计算方法有所不同，但2种方法的表达趋势基本一致，验证了转录组数据的可靠性。

图8 差异表达基因的荧光定量表达验证Fig.8 qRT-PCR validation of relative expression levels of differential expressed genes

2.7 褪黑素介导涝害响应的调控网络

图9为褪黑素参与的涝害响应调控网络，涝害发生后会产生低氧信号，通过转录因子与功能基因的相互作用，诱导相关基因的表达，从而抵御和适应逆境。褪黑素作为外源物质对植物耐受性获得具有一定促进作用，包括调控LAC、SRG、POD等相关的氧化反应酶活性，从而促进逆境响应和适应性。此外，褪黑素与低氧信号调控途径是否有关联，或在某个调控节点有关联有待进一步研究。

图9 桃响应涝害调控网络图Fig.9 Hypothesized regulatory mechanism for melatonin in the waterlogging response pathway

3 讨论

随着全球气候变暖，洪涝灾害时有发生，涝害已成为植物最常面对和危害最严重的非生物胁迫。植物在长久的生长过程中进化出了一套复杂的系统来感知和应对涝害胁迫。对相关响应机制的研究有助于对植物相关调控机理的理解，有助于培育具有抗逆性的作物品种。

褪黑素作为新型植物生长调节剂，它在调控植物抗逆性方面表现出优良效果。0.25 mol·L盐胁迫下，100 nmol·L外源褪黑素通过增强SOD活性，减缓膜质过氧化，提高了砧木葡萄5BB对NaCl的抵抗力。用100 μmol·L褪黑素对水稻进行浸种能提高幼苗在淹水胁迫下相关农艺性状与抗氧化酶活性，从而提高水稻存活率。本研究用200 μmol·L褪黑素对桃苗进行预处理再进行淹水胁迫，植株状态明显优于直接淹水的植株，膜脂过氧化程度较轻，根系活力得以维持。相关生理结果表明，褪黑素适用于提高桃耐涝性。

叶面喷施褪黑素和灌根处理能增加大豆的株高、叶面积和生物量，促进根系生长，增加根体积和表面积。蛋白组学研究发现，褪黑素抑制大豆根系木质化程度，减缓细胞降解，扩大细胞间隙从而缓解淹水胁迫对大豆种苗的伤害。本研究中，在苗期对桃植株进行褪黑素预处理和淹水处理，结合转录组测序技术，获得了大量差异表达基因，如编码LAC(漆酶)、SRG(锌指蛋白)、ACO(ACC氧化酶)、POD(过氧化物酶)等蛋白的基因。褪黑素预处理后，桃根系微管形态建成与氧化还原反应等相关基因差异表达，强化根系，提高了植株抵抗能力，尤其是应对淹水导致的低氧环境。

转录因子能特异结合基因启动子区的顺式作用元件，进而激活或抑制靶基因的转录，参与植物生长发育、胁迫应答等过程。研究表明，AP2/ERF、MYB、bHLH等转录因子与涝害相关。ERF是AP2/ERF家族的5个亚家族之一，与涝害胁迫最为紧密，通过GCC-box或HRPE元件调控一系列逆境基因表达，从而提高植物抗低氧能力。Wei等发现，小麦.1在耐涝和敏感品种中表现出差异的表达模式，组成型表达表明.1具有耐涝功能。猕猴桃2.3属于ERFⅦ组，该基因通过调控糖酵解途径关键酶基因和的表达水平增强转基因烟草的耐涝性。桃植株经受涝害后，共同差异表达基因在GO term“DNA-binding transcription factor activity”显著富集，该分类全部为转录因子，大部分为上调表达，其中AP2/ERF成员最多(34/108)，包含29个ERF亚族成员(29/34)，进一步说明ERF转录因子在涝害响应中的特殊地位。结合拟南芥ERF家族进化树分析，将桃ERF家族分为11个组，其中第Ⅶ组成员Prupe.8G264900的FPKM表达量最高，其可能为桃响应涝害的关键基因。

涝害发生后，糖酵解途径和乙醇代谢途径是植物主要的能量来源，PDC、ADH、LDH被认为是涝害相关的关键酶。Wei等发现，芝麻遭遇涝害后，涝敏感品种中LDH活性显著增加，表明乳酸在敏感品种中积累较多。在耐涝品种中主要表现为PDC活性和ADH活性的增加，该途径主要产生乙醇。KEGG富集分析用于差异表达基因的功能注释，能进一步了解差异表达的基因的相关功能和作用通路。受涝害胁迫后，桃差异表达的基因集中于糖酵解途径“glycolysis and gluconeogenesis”，该途径中上述ADH和PDC，以及ALD、PFK的编码基因大量上调表达，表明这些差异基因与桃响应涝害相关。与耐涝芝麻代谢途径类似，桃的乙醇代谢途径更为活跃。结合ERF转录因子与启动子的结合特性，以及糖酵解途径差异基因的启动子区域分析，预测到、、、、是ERF家族的靶基因。、等基因上调表达促进机体糖酵解产生ATP，为桃提供能量抵御低氧环境。

综上所述，根系淹水对桃植株造成涝渍胁迫，低氧环境抑制根系呼吸，根系活力下降，机体内部氧化产物过量生成，植物通过应激反应，启动相关基因的表达，包括转录因子与功能蛋白。本研究发现，ERF转录因子家族成员迅速响应低氧胁迫，积极上调表达，最显著的是Ⅶ组的Prupe.8G264900，通过HRPE和GCC-box元件的结合作用，调控下游糖酵解途径关键酶基因的表达，协同完成涝害应答和适应性反应。褪黑素是否参与ERF响应涝害的调控网络有待进一步研究。