七氟醚对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元ATP酶活性的影响及其机制分析

缺血性脑卒中是导致全球人类死亡和残疾的主要原因之一。除可导致各种严重的身体缺陷(包括认知功能障碍)外，还可能具有导致学习障碍和运动障碍的风险，从而影响患者的生活质量

。缺血再灌注损伤(IRI)常发生于当一段时间血液供应不足后，随后的血液进行再灌注，引起的一种缺血器官和组织的结构和功能无法恢复的神经损伤

。脑缺血后的再灌注可导致脑损伤，如神经元死亡、神经血管损伤、脑水肿以及出血性转化。脑IRI细胞损伤的机制包括炎症、细胞凋亡、活性氧和氮物质(ROS/RNS)的过量产生和兴奋性毒性

。尽管以前的研究表明，某些药物具有潜在的神经保护作用，如Pim-1激酶、肉桂蛋白和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，但另有研究表明这些药物的保护作用是间接的及有限的

。因此脑IRI仍然是心血管疾病研究的主要问题，需要进一步研究。七氟醚是一种挥发性的静脉内药物，常用于麻醉领域

。据报道，七氟醚预处理可通过促进小胶质细胞活化来诱导脑缺血损伤的内源性神经发生

。七氟醚麻醉与术后认知功能障碍有关，但可通过抑制核因子κB(NF-κB)/P6信号通路来缓解认知障碍

。先前的报道表明七氟醚可以增加脑IRI中的三磷酸腺苷ATP酶活性

，但具体的机制还尚未彻底阐明。本研究旨在探讨七氟醚对IRI大鼠海马神经元ATP酶活性的影响并分析其机制，为七氟醚的神经保护作用提供实验依据，同时为IRI的治疗提供新思路及新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 30只雄性SD大鼠购自沈阳药科大学实验动物中心，8～12周龄，180～250 g。所有大鼠饲养在室温(22±1)℃的动物房中，光/暗(12/12)循环，自由饮食。将所有大鼠随机分为3组：正常组，模型组和七氟醚组，每组各10只。

1.2 局灶性脑IRI大鼠模型构建 采用Longa提出的大脑中动脉闭塞(MCAO)对模型组和七氟醚组建立局灶性IRI大鼠模型。首先，大鼠给予腹膜内注射10%水合氯醛进行麻醉后，通过中线颈部切口暴露出翼腭动脉(PPA)、颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)。将0.23 mm的尼龙单丝引入右颈总动脉(RCCA)，结扎ECA和CCA的近端部分。用钳子夹住颈内动脉，用5-0针在CCA结扎区域切开一个切口，将腔内缝合线引入切口，并松开钳子。将腔内缝合线从CCA分叉处(约20 mm)插入，插入时感觉很顺畅，没有阻力，调整方向和角度，前进至颈小动脉前部的起始部位，有阻力阻碍。右脑中动脉栓塞，并用丝线缝合皮肤切口。缺血2 h后，小心取出腔内缝合线，然后进行再灌注。正常组除插入尼龙单丝外，其余方法与模型组相同。

1.3 七氟醚治疗 七氟醚组大鼠在建模过程中采用七氟醚治疗。大鼠麻醉后，采用呼吸机对大鼠进行插管和通气，潮气量为5 mL/100 g，呼吸频率为60～70次/min，呼吸商为1/2。呼吸机末端连接七氟醚麻醉，麻醉气体监测仪连接到动物呼吸机的进气口。然后解除麻醉机的自发呼吸模式，给大鼠补充氧气2 L/min，在建模手术过程中用麻醉气体监测仪吸入1.5%的七氟醚。正常和模型组大鼠给予100%新鲜空气，30 min/次，1次/d。监测生理指标并使大鼠直肠温度维持在(37±0.5)℃。实验后，将大鼠断头处死，在冰上分离双侧海马，一部分置于液氮中速冻，并储存于－80 ℃以备Western Blot和RT-PCR检测。一部分放入2.5%的戊二醛中，于4 ℃固定2 h，用于电镜观察。其余部分置于4%的中性甲醛固定，用于免疫组化和免疫荧光检测。

1.4 电镜观察 将2.5%戊二醛固定后的海马组织用二甲砷酸盐缓冲液清洗，3次2 min。用1%四氧化锇进行后固定2 h，经各级乙醇脱水后用Epon618树脂包埋，将包埋后的组织用切片机切为500 nm厚的超薄切片。之后采用1%乙酸双氧铀初染，再用柠檬酸铅复染。用日本电子光学实验室提供的JEM-3200FS场发射透射电子显微镜观察组织切片，并进行拍照，放大倍数为60 000×。

1.5 免疫荧光 将各组大鼠海马组织用4%的中性甲醛固定12 h，经各级酒精脱水，二甲苯透明，将肾组织包埋于石蜡中，用切片机将含有组织的石蜡块切成5 mm厚的切片，用载玻片展片、捞片，备用。将上述组织切片在500 μL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗3 次，在室温下用0.5% Triton X-100 X透化20 min，PBS洗3次。在37 ℃培养箱中用10%胎牛血清(BSA)封闭30 min，滴加一抗(兔抗小鼠MAP-2抗体，1∶500，上海碧云天公司)，4 ℃盒中培养过夜。PBS洗3次，滴加荧光标记的二抗(兔抗小鼠MAP-2抗体，1∶200，上海碧云天公司)，37 ℃湿盒中避光孵育1 h，PBS洗3次。细胞核用二亚氨基-2- 苯基吲哚(DAPI)避光染色5 min，PBS洗4次，用荧光淬灭剂密封。在荧光显微镜下(日本Olympus公司) 观察并记录MAP-2阳性细胞在细胞总数中的百分比。

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2.5 各 组 大 鼠 海 马 组 织cAMP、PKA、CREB 和BDNF mRNA表达比较 与对照组相比，模型组大鼠海马组织cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表达显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表达显著增加(

＜0.05)。这些结果表明七氟醚可增加脑IRI大鼠海马组织cAMP、PKA、CREB和BDNF mRNA表达，见图5。

1.6 免疫组化 上述切片经常规脱蜡脱水后，3%过氧化氢(H

O

)室温孵育10 min，洗3次，置于PBS溶液中，微波加热至95 ℃保持10 min，冷却。5%胎牛血清封闭45 min，加入cAMP一抗(1∶50)或PKA一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜，洗3次，滴加二抗，室温孵育1 h，洗3次，加入SABC复合物，室温孵育1 h，洗3次，滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液，10 min后洗去，苏木精淡染细胞核，0.5%盐酸乙醇分化7 s，洗3次，经各级酒精脱水后透明，中性树胶封片。一抗、二抗、SABC复合物及DAB显色液均购自上海碧云天公司。奥林巴斯Olympus光学显微镜下观察目的蛋白的表达，并采用Image Pro Plus软件统计目的蛋白的阳性表达率。

2.1 各组大鼠海马组织电镜观察结果比较 正常组海马神经元细胞膜结构完整，细胞器丰富和染色体分布均匀。模型组海马神经元胞体萎缩，细胞膜呈现不完整迹象和染色质浓缩，聚集在细胞核边缘。七氟醚组海马神经元收缩明显减少，细胞形态明显改善。这些结果表明七氟醚可以减轻脑IRI大鼠的神经元损伤，改善细胞形态，见图1。

2.6 各 组 大 鼠 海 马 组 织cAMP、PKA、CREB 和BDNF蛋白表达比较 与对照组相比，模型组大鼠海马组织cAMP、PKA、CREB和BDNF蛋白表达显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织cAMP、PKA、CREB和BDNF蛋白表达显著增加(

＜0.05)。这些结果表明七氟醚可增加脑IRI大鼠海 马 组 织cAMP、PKA、CREB 和BDNF 蛋 白 表 达，见图6。

1.9 Western Blot 采用RIPA蛋白裂解液提取各组大鼠海马组织中的总蛋白，BCA试剂盒进行总蛋白的定量分析。将20 g总蛋白加入上样缓冲液中，用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，然后将总蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA封闭45 min，孵育一抗，4 ℃过夜，洗膜缓冲液(TBST)洗3次。加入二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗3次，采用电化学发光试剂(ECL)于暗室发光。采用美国Bio-Rad公司的凝胶成像系统及Quantity One 4.6.2软件对目的条带进行分析。GAPDH为内参。兔多克 隆 抗 体cAMP、PKA、CREB、BDNF 和GAPDH 抗体，山羊抗兔二抗均购自上海碧云天公司。

2.2 各组大鼠海马神经元损伤情况比较 正常组大鼠海马组织中MAP-2阳性神经元最多，胞体最大，突触最多。模型组MAP-2阳性神经元最少，胞体较小和突触最少。七氟醚组大鼠MAP-2阳性神经元和突触增加，并展现出增大的胞体。对MAP-2阳性细胞占细胞总数百分比的统计结果显示，正常组MAP-2阳性细胞占比(41.5±5.61)%，模型组占比(18.6±3.49)%，七氟醚组占比(32.8±4.57)%。与对照组相比，模型组大鼠海马组织MAP-2阳性细胞占比显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织MAP-2阳性细胞占比显著增加(

＜0.05)。这些结果进一步证实七氟醚可修复脑IRI大鼠海马神经元损伤，见图2。

2 结果

1.7 ATP酶活性检测 采用上海俊瑞生物技术有限公司提供的超纳米Na

-K

-ATP酶试剂盒和超纳米Ca

ATP酶试剂盒检测ATP酶活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.3 各组大鼠海马组织cAMP和PKA蛋白表达比较 对各组大鼠海马cAMP和PKA蛋白阳性表达统计结果显示，正常组cAMP阳性表达为(2.4±0.46)，模型组为(0.8±0.29)，七氟醚组为(1.9±0.31)。与对照组相比，模型组大鼠海马组织cAMP阳性表达显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织cAMP阳性表达显著增加(

＜0.05)。正常组PKA 阳 性 表 达 为(3.2 ±0.43)，模 型 组 为(1.1±0.28)，七氟醚组为(2.8±0.36)。与对照组相比，模型组大鼠海马组织PKA阳性表达显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织PKA阳性表达显著增加(

＜0.05)。这些结果表明七氟醚可增加脑IRI大鼠海马组织cAMP和PKA蛋白表达，见图3。

2.4 各组大鼠海马组织ATP酶活性比较 与对照组相比，模型组大鼠海马组织Na

-K

-ATP酶和Ca

-ATP酶活性显著降低(

＜0.05)。与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织Na

-K

-ATP 酶和Ca

-ATP酶活性显著增加(

＜0.05)。这些结果表明七氟醚可增加脑IRI大鼠海马组织ATP酶活性，见图4。

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脑IRI是全球医务工作者和科研人员的研究重点和难点。本研究探讨七氟醚对脑IRI大鼠海马神经元ATPase活性的影响，结果提示七氟醚可以通过激活cAMP-PKA信号通路来促进脑IRI大鼠海马神经元ATPase的活性。

1.8 RT-PCR检测 采用TriZol裂解液各组大鼠海马组织中的总RNA，分别检测总RNA 260 nm和280 nm处的吸光值A，根据A260/A280的比值对总RNA定量。之后取上述总RNA模板1 g，用反转录试剂盒(M-MLV)合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，加入SYBR mix、特异性引物和水，采用Bio-Rad荧光定量PCR仪进行扩增。同时用磷酸甘油醛脱氢(GAPDH)作为内参。采用2

计算目的基因的相对表达量。所有引物均由Primer designing tool软件(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计并由上海生工公司合成。

3 讨论

Levels of LD in proximal subtotal gastrectomy: (1)D0: LD in a volume less than D1; (2) D1: №1, 2, 3a,4sa, 4sb, 7; and (3) D1 +: D1 plus №8a, 9, 11p (Figure 4).

本研究电镜结果以及免疫荧光结果均显示七氟醚可改善大脑IRI大鼠海马神经元的形态，并增加海马神经元的含量。这与先前的报道一致，七氟醚后处理可通过恢复线粒体形态来减弱心肌细胞的缺氧/复氧损伤

。另一项研究也表明，七氟醚可抑制心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)后的心肌组织凋亡

，具有心脏保护作用。这些研究及结果显示，七氟醚可修复脑IRI后海马神经元的结构，在神经元保护中起重要作用。

在社会主义市场经济条件下，涉及到矿产资源资产的资源交易、矿业市场融资、股东权益分配、监管、国际矿产资源资产交流等方面内容日趋增多，为适应市场发展的需求，促使矿产资源资产评估更好地融入现代资本市场，我们更应该加快我国矿产资源资产标准规范的制定工作，增强矿产资源资产评估过程中的资产认定、属性、资产边界、产权标准、关键术语定义、评估原则等方面的规范和研究，建立一套适应于我国国情的矿产资源资产评估标准体系，对于协助矿业企业管理决策、协助矿产资源资产行政管理和监督管理、完善矿业企业的公司管制、促进矿业企业融资和相关交易等具有重要意义。

研究报道七氟醚可增强ATPase的活性

。这与我们的研究一致，七氟醚可以增加IRI大鼠海马组织Na

-K

-ATP酶和Ca

-ATP酶活性。先前的体外研究表明，七氟醚对干扰素调节因子6(LPS)损伤的Ⅱ型人肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)中的Na

-K

-ATP酶具有刺激作用

。研究报道，当用缺乏细胞外钙的培养基灌注胆碱能细胞时，七氟醚诱导的Ca

-ATP酶活性仍保持上调

。已发现七氟醚可通过改善心内膜下心肌线粒体形态和血流动力学，阻断mPTP的开放和激活线粒体KATP通道来减少心肌梗死面积

。也有报道显示，一些挥发性麻醉剂(如地氟醚、氟烷、异氟烷或七氟醚)对肾脏IRI具有深远的保护作用

。其他研究还表明，七氟醚可通过转化生长因子β

途径来预防肾脏IRI

。这些研究均显示，七氟醚可增强ATPase的活性。

4）获得多项国家及行业荣誉称号。中海建滔、中海化学、惠州炼化、湖北大峪口分别荣获了国家发改委、工信部、中国石油和化学工业联合会颁发的甲醇、合成氨、原油加工和磷酸二铵“能效领跑者标杆企业”称号；有限公司湛江分公司等三家企业因节能工作突出分别获得全国总工会“全国五一劳动奖章”、“工人先锋号”等荣誉称号。

Na

-K

-ATP酶是位于肾脏近端小管的整合性膜蛋白，其作用是为某些溶质的重吸收和分泌提供能量。Na

-K

-ATP酶活性紊乱与脑IRI的病理生理有关。IRI可导致三磷酸腺苷(ATP)合成降低，并进一步导致ATPase活性下降

。已证明肾脏Na

-K

-ATP酶参与脑IRI的脑水肿和神经元损伤的调控过程，这是脑IRI的中枢发病机制

。据报道Na

-K

-ATP酶在七氟醚对IRI的保护中具有重要作用

。此外，ATPase活性受cAMP-PKA信号通路的调控

。我们的研究进一步证明七氟醚可通过上调大鼠海马神经元中cAMP、PKA、CREB和BDNF的表达来改善海马神经元。研究表明，cAMP/CREB信号的下调参与七氟醚-一氧化二氮全身麻醉引起的神经毒性和认知功能障碍过程

。另有研究证明cAMP/CREB级联对新生海马神经元的成熟和分化有很大影响，而cAMP信号通路的激活可以促进海马神经元的形态成熟

。吸入性七氟醚已被证明可促进离体血小板中α

-肾上腺素信号传导中PKA活性的显著增加

。BDNF是cAMP-PKA-CREB-BDNF信号通路的下游元素

。七氟醚可能通过调节海马BDNF表达来抑制应激增强的恐惧学习

。

综上所述，本研究表明七氟醚可以通过激活cAMP-PKA-CREB-BDNF信号通路来促进脑IRI大鼠海马神经元的ATPase活性，进一步改善脑IRI，这可能为脑IRI的治疗提供新思路。

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