红树莓酵素对伊犁马肠道菌群结构及其免疫调节机制的研究

刘骁蒨，向 葵，桂全安

（1.武汉商学院体育学院/国际马术学院，湖北 武汉 430056；2.四川农业大学，四川 成都 611130）

中国有着悠久的养马历史，也是马种资源非常丰富的国家之一。伊犁马是我国最重要和最优秀的地方马种之一[1-4]，其皮毛粗厚、四肢短粗、肩短直立、背腰平直、胸廓宽深、鬃甲低宽、头颈粗重，具有抗病力强、耐寒、适应性强等特性[5-6]。其抗病耐寒等特性与肠道菌群结构和多样性密切相关[7]。研究表明，肠道菌群对马肠道黏膜扮有着双重功效，一方面，肠道菌群及其代谢物对肠道黏膜有危害，如毒素、多胺类、吲哚衍生物[8]；另一方面，肠道菌群及其代谢物会产生一些营养物质，满足宿主肠道的需求，激活肠道免疫，如提高免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8 的含量[9]。然而，目前人们对该领域的关注极少。因此，加大我国优良地方马肠道菌群的研究，开发相关微生物类制剂对马无抗养殖和疫病的生物防控具有重要意义。

红树莓（Rubus ideausL.）是蔷薇科悬钩子属灌木植物，其果实富含氨基酸、黄酮、花青素、维生素、多糖等，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、改善菌群结构等功效[10]。酵素是指用一种或多种果蔬破碎、榨汁后，添加一种或多种益生菌发酵而来，富含多种次级代谢物、生物酶、维生素等[11]。近年来研究发现红树莓具有较高的抗氧化活性[12]，将其加入益生菌发酵后可能会对动物肠道菌群及免疫系统产生积极影响。为验证该推测是否正确，本研究通过在伊犁马日饲料中添加红树莓酵素，研究其对伊犁马肠道菌群结构和免疫系统的影响，并初步确定其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料红树莓酵素购自山东天随生物科技有限公司，生产许可证号SC10637150100152；24匹健康状况良好、遗传背景一致、公母各半的伊犁马购自新疆伊犁哈萨克自治州伊犁地区。碱性磷酸酶活性测定试剂盒购自南京建成有限公司； TRIzol试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix 和qPCR 试剂盒，均购自TaKaRa 公司；免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8 的ELISA 检测试剂盒，均购自上海通蔚实业有限公司。

1.2 实验设计将24匹伊犁马每组公母各半随机平均分为4 组，分别为空白对照组、低剂量红树莓酵素添加组（0.1 g/kg）、中剂量红树莓酵素添加组（0.2 g/kg）和高剂量红树莓酵素添加组（0.4 g/kg），实验周期28 d。空白对照组马正常饲养，各红树莓酵素添加组马每日于日粮中添加上述相应剂量的红树莓酵素。根据NRC（1998）中马匹营养需求配制日粮[13]，分栏饲养于北京京华兴马场马匹驯养中心，温度控制在25 ℃～28 ℃，湿度控制在60%左右，自由采食和饮水，其他日常管理均参照常规马饲养管理方法。

1.3 各组马肠道微生物菌群的测定实验期间观察各实验组伊犁马的腹泻状况，确定红树莓酵素是否对马具有毒副作用。确定无影响后于实验第28 d，每组选取2 匹健康状况良好、个头中等的伊犁马，用戊巴比妥钠将其麻醉后，采集带有食糜的盲肠肠段和小肠肠段，包括十二指肠、回肠、空肠、结肠等，参考刘永忠等[14]方法测定肠道微生物菌群，分析红树莓酵素对伊犁马肠道菌群的影响，同时测定各组马各肠道pH 值。

1.4 各组马小肠黏膜纤维素酶基因转录水平的检测取1.3中带有食糜的小肠肠段，肠道利用TRIzol试剂盒从马肠组织中提取总RNA，反转录为cDNA。根据已经登录的纤维素酶关键酶基因melA序列，设计引物5'-TGCTCTAGATATGAAACGGTCAATCTCTAT-3'/5'-C CAAGCTTCTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3'，以获得的cDNA 为模板，利用qPCR 试剂盒检测伊犁马小肠黏膜中纤维素酶基因的转录水平。

1.5 肠道黏膜形态结构检测选取各组剩余实验马中的2 匹，采集各肠段制作切片，均采用电镜观察整个消化道形态结构变化。

1.6 各组马外周血单核细胞中免疫因子转录水平的测定采用前腔静脉采血法，于剖杀前采集1.5中各组马抗凝血，采用非连续性密度梯度离心法分离单核细胞，利用TRIzol试剂盒提取单核细胞总RNA后，采用PrimeScriptTMRT Master Mix 反转录获得cDNA，以其为模板，分别采用表1中相应引物，利用qPCR试剂盒检测各组马外周血单核细胞中TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8基因的转录水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 红树莓酵素对各组马外周血中免疫因子表达水平的影响取1.6中采集的各组马前腔静脉血，分离血清，利用相应ELISA 试剂盒检测各组实验马血中免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8的表达水平。

1.8 数据统计与处理本研究中所有数据均采用SPSS17.0 进行分析，结果以“-x±s”表示，P＜0.05 表示二者间差异显著，P＜0.01 表示二者间差异极其显著。

2 结 果

2.1 红树莓酵素对伊犁马肠道菌群及pH 值影响的检测观察各组伊犁马腹泻状况，结果显示各实验组和对照组马腹泻状况均无差异（P＞0.05），表明饲喂红树莓酵素不会影响伊犁马基本健康，可进行后续实验。

采集各组马各肠段食糜，检测肠道菌群，结果显示，与对照组相比，红树莓酵素添加后伊犁马空肠和盲肠总菌（大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌）含量显著增加（P＜0.05），且增幅与红树莓酵素添加量成正比（表2）。进一步对各肠段pH值检测，结果显示，红树莓酵素可以改善伊犁马肠道pH 值，使其维持在6.25～7.25，有利于益生菌菌群存活增殖，且各肠段均以红树莓酵素高剂量添加组改善最明显（表3）。上述结果表明，饲喂红树莓酵素后可能会通过影响伊犁马肠道pH 值来改善肠道菌群结构。

表2 红树莓酵素对伊犁马肠道菌群影响的检测结果Table 2 The effect of red raspberry enzyme on the intestinal flora of Yili horse

表3 红树莓酵素对伊犁马肠道pH值影响的测定结果Table 3 The effect of mangrove enzymes on the pH value of the intestine of Yili horse

2.2 各组马小肠黏膜纤维素酶melA基因转录水平的检测结果采用qPCR 检测各组伊犁马小肠黏膜中melA基因转录的情况，结果显示，与空白对照组比较，红树莓酵素高剂量添加组和中剂量添加组中melA基因转录水平极显著增高（P＜0.01），其次是红树莓酵素低剂量添加组显著升高（P＜0.05），且melA基因转录水平与红树莓酵素剂量呈正相关（图1）。表明红树莓酵素能够增加伊犁马肠道中菌群和消化能力。

图1 各组伊犁马小肠黏膜中纤维素酶melA基因转录水平的检测结果Fig.1 Expression of cellulase gene in small intestinal mucosa of Yili horse

2.3 红树莓酵素对伊犁马肠道黏膜形态结构的影响电镜下观察各组马小肠黏膜形态结构，结果显示，各组伊犁马空肠比较，红树莓酵素高剂量添加组空肠绒毛排列整齐且密集，长度也略有增加，黏膜形态结构明显优于其他组；其次是红树莓酵素中剂量添加组，最后是红树莓酵素低剂量添加组和空白对照组（图2）。而其他肠道，如十二指肠肠、结肠、回肠及盲肠等的黏膜形态结构与对照组比较较无明显差异（图略）。表明高剂量的红树莓酵素有助于伊犁马小肠黏膜良好发育。

图2 红树莓酵素对伊犁马空肠黏膜形态结构及发育的影响Fig.2 The effects of red raspberry enzymes on the morphological structure and development of the jejunum mucosa of Yili horse

2.4 各组马外周血单核细胞中免疫相关基因转录水平的测定结果利用qPCR 检测各组马外周血单核细胞中免疫相关基因的转录水平，结果显示，各实验组与对照组比较，马外周血单核细胞中免疫因子TLR4、CD14、MD2、IFN-β基因转录水平均显著上调（P＜0.01），而TNF-α、IL-1β、IL-8均显著下调（P＜0.01），且调节幅度与红树酶毒素添加剂量成正比。TLR4是革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的识别受体，其识别还需要CD14、MD2 等因子共同参与，激活下游MyD88 非依赖通路，进而引起I 型干扰素IFN-β 等表达。本研究中红树莓酵素添加后，会引起马外周血免疫因子CD14、MD2基因转录水平上调，有助于TLR4 受体的识别，从而激活MyD88 非依赖通路，促进I 型干扰素IFN-β 表达（图3）。表明红树莓酵素通过增加伊犁马免疫相关基因的转录水平来增强马免疫系统的免疫应答。

图3 各组伊犁马外周血单核细胞中免疫相关基因转录水平的检测结果Fig.3 Transcription level of immune-related genes in monocytes of Yili horse

2.5 各组马外周血免疫因子表达水平的测定结果中高剂量红树莓酵素添加后，马外周血免疫因子检测结果显示，免疫因子IFN-β 的表达水平显著上调（P＜0.05），TNF-α、IL-1β、IL-8 的表达水平显著下调（P＜0.05），且调节幅度与红树莓酵素的剂量相关。可见各组炎性相关的免疫因子TNF-α、IL-1β、IL-8的表达水平均下调，参与吞噬、细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢、凝固和神经传递等生物调节过程的IFN-β表达上调，与2.4的结果一致（图4）。但低剂量红树莓酵素添加组各免疫因子变化不显著。进一步表明红树莓酵素能够减少机体的炎性反应，增强伊犁马免疫系统，且该作用对红树莓酵素呈剂量依赖性。

图4 各组马外周血中免疫因子表达水平的测定结果Fig.4 Determination of immune factor content

3 讨 论

胃肠道菌群生态系统是人和动物体内最庞杂的生物系统。机体内肠道菌群会随着生长环境的改变而改变，并且不同消化部位种群数量和种类也有所差异[15]。研究发现干酪乳杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌能够显著改善吡嗪酰胺致肝损伤大鼠的肠道菌群紊乱[16-17]；贺燕等研究发现拟杆菌门、变形菌门、脱铁杆菌门等能够显著损伤小鼠肠道黏膜[18]。由于肠道菌群对机体肠道状况有着非常重要的作用，因此研究机体肠道菌群结构具有重要意义。本研究发现空肠中，与对照组相比，红树莓酵素添加后伊犁马空肠总菌含量显著增加（P＜0.05），且增加幅度与红树莓酵素含量成正比。对空肠总菌分析结果显示，其总菌中含有大量双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌，且菌群结构也得到改善。

小肠的主要功能是消化吸收营养物质。赵冰婕等研究发现，红树莓酵素能够显著改善I 型糖尿病小鼠肠道菌群，且对其代谢物有显著影响[19]。本研究通过电镜观察结果显示，红树莓酵素高剂量添加组改善空肠绒毛效果最显著，其排列整齐且密集，长度也略有增加；其次是红树莓酵素中剂量添加组、红树莓酵素低剂量添加组和空白对照组。而其他肠道，如十二指肠肠、结肠、回肠及盲肠等形态结构无显著差异。电镜下观察伊犁马各组空肠黏膜形态结构，发现红树莓酵素高剂量添加组效果最好。推测红树莓酵素能够改善动物肠道黏膜形态结构。可见红树莓酵素对肠道黏膜形态结构的改善有利于提高机体免疫力，该推测也通过本实验后续对各实验组马机体免疫因子的变化检测得到印证。

研究发现，宿主口服益生菌（包括来源于原籍菌群和外籍菌群）后，可使分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）分泌增强，提高机体免疫识别力，诱导巨噬细胞和T、B 淋巴细胞产生细胞因子，增强宿主免疫功能[20]，因此肠道益生菌群与宿主免疫有密切关系。为了验证红树莓酵素是否通过改善肠道益生菌群结构来提高机体免疫能力，本研究通过检测外周血中免疫因子的表达和外周血单核细胞中免疫因子的转录水平，分析红树莓酵素对伊利马机体免疫系统的作用机制。TLR4 是革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的识别受体，研究表明，TLR4 受体识别还需要CD14、MD2 等共同参与，激活下游MyD88 依赖和非依赖通路[21]。MyD88 依赖通路进一步促进炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等表达；MyD88非依赖途径则会引起I 型干扰素IFN-β 等表达[22]。本研究检测伊犁马外周血单核细胞中免疫相关基因的转录水平发现，与对照组相比，红树莓酵素处理后，伊犁马外周血周中免疫因子CD14、MD2、TLR4、IFN-β转录水平会显著升高（P＜0.05），而炎性相关的TNF-α、IL-1β、IL-8 的转录水平显著降低（P＜0.05），且升高与降低幅度均具有红树莓酵素剂量依赖性。进一步可见添加红树酶酵素有助于CD14、MD2 参与TLR4受体识别，偏向于激活MyD88 非依赖通路，从而促进具有增强免疫功能的I 型干扰素IFN-β 的表达，而MyD88 依赖通路相对被抑制，避免促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等表达水平提高。进一步利用ELISA 检测伊犁马外周血中免疫相关因子的表达水平，与上述结果一致。可见红树莓酵素可能是通过激活革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖受体TLR4，进而调控其下游MyD88 依赖和非依赖通路，提高机体免疫反应，减少机体炎性反应。

肠道作为宿主最大的免疫器官具有完善的免疫功能，同时肠道菌群除了对宿主有多种有益的生理和营养作用外，还具有促进宿主免疫系统形成和成熟、在调节免疫细胞、增强免疫力等方面起着重要作用[23]。随着现代分子生物技术的发展，肠道结构及菌群对宿主的影响研究已进入细胞和基因层面，研究发现能够改善肠道菌群及肠道组织结构的药剂，尤其是天然制剂，对宿主免疫系统增强及其疾病微生态疗法具有重要的意义。本研究通过给伊犁马添加红树莓酵素，首次证实红树莓酵素通过改变肠道pH 值促使肠道益生菌群数量显著增加，同时优化了肠道黏膜形态，增强了伊犁马机体免疫力，但相关具体机制还需进一步深入研究，本研究为马的无抗养殖和疫病生物防控奠定了基础。