不同营养级生物毒性监测预警比较研究

王 树 磊，肖 新 宗，郭 文 思，陈 珊，王 源，王 英 才

(1.南水北调中线干线工程建设管理局，北京 100038； 2.南水北调中线干线工程建设管理局 河南分局，河南 郑州 450018； 3.生态环境部长江流域生态环境监督管理局 生态环境监测与科学研究中心，湖北 武汉 430010)

0 引 言

水质安全直接关系到人类的生产与发展[1]。自改革开放以来，中国水污染问题逐渐加重，大量未处理的污水直接排入江河湖泊甚至灌入地下河中，严重影响了城镇饮水安全和水环境状况，加剧了水资源问题[2-4]。与此同时，随着工业、农业的发展，水体污染物类型逐渐呈现复杂化、多样化、毒性不确定性等特征，还有一部分污染物属于未知污染物质，其污染原因及风险危害等均未知[5-6]。随着人类对健康水质的需求不断提高，水质安全评价与预警的效率也需提高。传统水质安全评价主要基于理化监测结果与水质标准,如GB 3838-2002《地表水环境质量标准》、欧盟的水环境标准体系等的对比，这虽能直观反映水体污染物含量是否超标，但不能直接全面反映污染物对水环境的综合影响，不能指示水生态系统是否安全和水体存在的潜在风险[5-7]。生物毒性监测能直观反映水体中所有共存污染物的综合毒性特征，可指示水体潜在风险，被广泛应用于饮用水、工业废水等环境水体评价[8-14]。

生物毒性监测预警技术是利用指示生物对水质异常变化的行为反映或生理变化来实现水质监测预警[9]。国内外当前生物毒性监测技术主要是基于鱼类、溞类、藻类及发光菌等指示生物开展的研究，且已从单一指示生物发展到多种生物联合预警，涵盖各种生物毒性终点的水质评价体系也在逐步完善中，这对于水质安全管理与保护具有重要意义[15-17]。其中，鱼类是地表水生态系统中最主要的脊椎动物，处于食物链的顶端，常作为指示生物用于单一污染物或多种污染物的综合毒性效应监测[18-26]。溞类是水生态系统中的初级消费者，对水环境中的有毒有害物质表现出高度的敏感性，常作为国际标准试验生物被广泛应用于水污染监测和有毒有害物质的生物综合毒性评价[27-32]。藻类是水生生态系统的主要初级生产者，其种类多样性和数量直接影响水生态系统的结构与功能。与此同时，藻类的生理生化及其种类、数量、生产力等也受水体环境影响，在毒理评价及污染监测中应用广泛，已逐渐成为水环境质量变化的重要指标[33-36]。发光菌是一种在正常生理条件下能发出荧光的微生物，利用其在污染物的胁迫下发光度的抑制率来表征毒性大小，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段[37-40]。本文重点研究了4种不同营养级指示生物对不同污染物的响应，比较了4种指示生物对污染物的响应阈值、响应时间及响应范围，以期为水质安全评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验选用的斑马鱼、蛋白核小球藻均由中国科学院水生生物研究所(武汉)提供，大型溞由生态环境部南京环境科学研究所提供，并由本实验室驯化培养。其中，斑马鱼培养方法参照国家GB/T13267-1991《水质、物质对淡水鱼类(斑马鱼)急性毒性测定方法》；大型溞经驯养后选取三代孤雌生殖72 h左右的同一子代；费氏弧菌(V.fischeri)由美国Microtox公司提供冻干菌粉活化2 h内进行实验。

受试毒物为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、硝基苯、汞、锰、砷、锌、铁等重金属或有机毒物，毒物浓度分别参照国家Ⅲ类水的限制浓度的1倍、10倍及100倍进行试验。

1.2 方法

1.2.1鱼类

实验采用新加坡睿克公司(ZWEEC Analytics)研发的鱼类生物毒性在线监测仪(FAMS)进行测试。当毒性物质进入水体时，鱼类的行为会发生改变，通过高频摄像记录及数据库对比，分析斑马鱼在短时间内暴露于不同浓度毒性物质下的行为变化及死亡率，并结合多种水质参数传感系统来准确快速地分析和判断待测水体的毒性强弱。仪器根据不同等级，发出褐色、黄色及红色3种预警信号。褐色预警表示水质有可能已经被污染，此时鱼群行为出现异常；黄色预警表示水质已经达到临界阶段，25%～50%的鱼群已经死亡；红色警报表示水质已经达到临界阶段，50%的鱼群已经死亡[18]。

向观测水槽内加入标准稀释水并加入一定数量的斑马鱼(10尾以上)，待斑马鱼活动稳定后进行背景学习(一般时长为2～4 h)，此时测定的行为指标可作为空白参照。将配置好的受试毒物迅速加入观测槽内，待水体稳定后进行循环监测，实验时间为4 h，实验期间保证环境不受人为扰动。根据《水与废水监测方法(第四版)》，急性鱼类毒性试验标准要求是pH 6.0～8.5，用稀释水作为试验用水。稀释水配方如下：配置标准稀释水所用试剂应为分析纯，并使用蒸馏水或去离子水配置。①氯化钙溶液：将11.76 g GaCl2·2H2O溶解于水中，稀释至1 L。②硫酸镁溶液：将4.93 g MgSO4·7H2O溶解于水中，稀释至1 L。③碳酸氢钠溶液：将2.59 g NaHCO3溶解于水中，稀释至1 L。④氯化钾溶液：将0.23 g KCl溶解于水中，稀释至1 L。蒸馏水或去离子水的电导率应≤10 μS/cm。将这4种溶液各取25 mL加以混合并用水稀释至1 L，稀释水的pH范围在6.8～8.0。

1.2.2溞类

实验采用德国BBE公司生产的溞类毒性仪器进行测试。通过分析大型溞的运动速度、运动高度、运动方向、个体大小、运动大型溞的个数、被探测到的频率、运动轨迹个数等，计算污染物的综合毒性指数，当综合毒性指数达到一定阈值(可设定)，系统便启动报警机制，对水质的综合毒性指数做出评估与预警。

受试大型溞使用标准稀释水驯化。将大型溞转移至观测槽内并注满标准稀释液，加入溞类个数12～20只，待大型溞活动稳定后，注入配置好的毒物溶液并弃去早期废液，待溶液浓度稳定后进行循环监测，实验时间为24 h。实验参照国家标准GB/T 16125-1995方法，采用标准稀释水对大型溞进行驯化培养，并以自培养的蛋白核小球藻为食，每 24 h喂食一次。标准稀释水满足以下要求并容许溞类在其中生存至少48 h：pH为7.8±0.2，硬度为(250±25) mg/L(以CaCO3计)，Ca/Mg的比例接近4∶1，溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上。标准稀释水配置方法为：① 氯化钙溶液，将11.76 g CaCl2·2H2O溶解于蒸馏水中，并稀释定容至1 L；② 硫酸镁溶液，将4.93 g MgSO4·7H2O溶解于蒸馏水中，并稀释定容至1 L；③ 碳酸氢钠溶液，将2.59 g NaHCO3溶解于蒸馏水中，并稀释定容至1 L；④ 氯化钾溶液，将0.23 g KCl溶解于蒸馏水中，并稀释定容至 1 L；取上述4种溶液各 25 mL 加以混合并用水稀释至 1 L。必要时可用 NaOH溶液及 HCl溶液调节pH。

1.2.3藻类

实验采用德国BBE的藻类在线水质分析毒性仪进行测试。该仪器通过实时监测与分析藻类荧光强度，对水质的综合毒性指数做出评估与预警。蛋白核小球藻藻液在无菌接种后的带塞密封，置于人工气候培养箱中静置培养，培养箱的光照强度调为4 000 lux，温度调为(25±1) ℃，光暗比为12 h∶12 h。培养过程中定时摇动锥形瓶3～5次，每天随机调换三角瓶的位置2～3次。定期显微镜镜检藻类生长状况，若生长良好，且无变形和不正常细胞，说明藻种已经适应实验条件，待藻密度稳定到4 000 cells/L左右进行实验。

受试毒物采用去离子水定容配置，通入毒物后试验时间为5 h以上。藻液浓度明显下降即更换藻液，一般每两周更换一次。参比毒物为10 μg/L的敌草隆溶液，参比水为循环水。藻种培养所用培养基均为 BG11(Blue-Green Medium)，根据中科院淡水藻种库的配方配置(见表1)，培养基的配制方法为首先配制成储备液，放置在冰箱中4 ℃保存，转接藻种前将其配制成工作液即培养基，培养基的配制应严格按照表2的顺序依次加入超纯水中，待一种试剂完全混匀后再加入另一种，添加过程中不断搅拌，用超纯水定容到 1 000 mL，然后用 NaOH或者HCl调节pH至7.1，在121 ℃下高压灭菌20 min，冷却至常温后便可使用。

表1 G-11培养基配方Tab.1 Formula of G-11 medium

表2 BG-11中A5的配方Tab.2 Formula of A5 in BG-11

1.2.4发光菌

实验使用以色列CheckLight公司生产的ToxScreen Ⅲ毒性测试仪进行毒性测试。发光菌的生物毒性测试是利用其在污染物的胁迫下发光度的抑制来反映污染物综合毒性强弱。

选用活化液配制毒物贮备液，并置于4 ℃环境储存备用。实验设置空白对照，预先在测试管中加入1 000 μL不同浓度毒物储备液。活化菌液后，向每只测试管中加入100 μL的工作菌液，吹吸混合均匀，加入菌液的间隔时间不少于30 s。急性毒性试验的反应时间为15 min，实验过程中保证菌液始终保持在20 ℃环境下。

2 结果与讨论

2.1 鱼类毒性监测预警

斑马鱼毒性实验结果显示(见表3)，斑马鱼对有机物邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、硝基苯、汞、锰盐及砷溶液的敏感性较弱，各毒物在最高浓度时其综合毒性指数均未达到阈值，未报警。斑马鱼对锌溶液较敏感，在其浓度达到100倍国家限制标准浓度时，红色报警；在其浓度达到10倍国家限制标准浓度时，鱼群游速明显减缓且鱼群聚集，引起黄色报警；在其浓度达到1倍国家限制标准浓度时，鱼群表现较为正常。斑马鱼对铁溶液也较为敏感，但考虑到斑马鱼对水环境的pH较为敏感，适宜中性偏碱环境，而在此环境下铁溶液易形成不溶性沉淀影响水质，对斑马鱼造成物理性损伤，故毒物铁对斑马鱼的毒害作用有待进一步研究。

表3 斑马鱼对不同毒性物质的响应Tab.3 Response of zebrafish to different toxic substances

2.2 溞类毒性监测预警

大型溞毒性实验结果显示(见表4)，大型溞对有机物邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、硝基苯、汞及锰溶液的敏感性较弱，各毒物在最高浓度时其综合毒性指数均未达到阈值，未报警。大型溞对砷溶液敏感，在其浓度达到100倍国家限制标准浓度时，红色报警；在其浓度达到10倍国家限制标准浓度时，未引起报警。大型溞对锌溶液极敏感，在其浓度达到国家1倍限制浓度时，即能引起红色报警。大型溞对铁溶液也极为敏感，在其浓度达到1倍国家限制标准浓度时，即引起报警，但同斑马鱼一样，待进一步研究。

表4 大型溞对不同毒性物质的响应Tab.4 Response of Daphnia magna to different toxic substances

2.3 藻类毒性监测预警

蛋白核小球藻毒性实验结果显示(见表5)，蛋白核小球藻对有机物邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、硝基苯、汞、锰盐及砷溶液的敏感性较弱，各毒物在最高浓度时其综合毒性指数均未达到阈值，未报警。小球藻对锌溶液敏感，在其浓度达到10倍国家限制标准浓度时，抑制率即已接近报警阈值；在其浓度达到100倍国家限制标准浓度时，红色报警。蛋白核小球藻对铁溶液敏感，在其浓度达到10倍国家限制标准浓度时，抑制率即已接近报警阈值，藻密度明显下降；在其浓度达到100倍国家限制标准浓度时，红色报警。

表5 蛋白核小球藻对不同毒性物质的响应Tab.5 Response of Chlorella pyrenoidosa to different toxic substances

2.4 发光菌毒性监测预警

费氏弧菌毒性实验结果显示(见表6)，费氏弧菌对有机化合物邻苯二甲酸二丁酯以及邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的敏感性较弱；对硝基苯、汞、锰、砷、锌及铁溶液的敏感较强，对半数效应浓度EC50，响应程度汞>硝基苯>锌>锰>砷>铁。除锌和硝基苯外，其他毒物检测浓度的半数效应浓度EC50均高于或远高于国家Ⅲ类水质标准。各拟合曲线的相关系数R2达到0.93～0.99，表明实验中各毒性物质与费氏弧菌的发光抑制率呈现良好的剂量-效应关系。

表6 费氏弧菌发光抑制率与不同毒性物质的回归方程Tab.6 Regression equation of luminescence inhibition rate of Vibrio fischeri to different toxic substances

2.5 四种指示生物毒性监测预警比较

从斑马鱼、大型溞、蛋白核小球藻及费氏弧菌对各毒性物质的预警结果可知：斑马鱼对锌和铁较敏感，达到预警效果；对其他毒性物质均不敏感，未达到预警效果。大型溞对砷敏感，对锌及铁极敏感，达到预警效果；对其他毒性物质均不敏感，未达到预警效果。蛋白核小球藻对锌和铁敏感，达到初步预警效果；对其他毒性物质都不敏感，未达到预警效果。费氏弧菌硝基苯、汞锰、砷、锌、铁都极敏感，达到预警效果；对两种有机物邻苯二甲酸二丁酯以及邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯不敏感，未达到预警效果。以上结果显示不同指示生物对不同污染物响应差异显著，预警效果不一。

从斑马鱼、大型溞、蛋白核小球藻及费氏弧菌对18种毒性物质(其中8种为本实验所得数据，其余10种为已有数据)的响应时间和响应阈值可知(见表7和表8)：斑马鱼对毒物的响应比较广，响应阈值相对较高[15]；大型溞敏感度最强，对毒物的敏感程度整体高于斑马鱼、费氏弧菌及蛋白核小球藻，响应阈值相对较低，响应时间相对较长[15]；蛋白核小球藻对毒物响应比较窄，对除草剂及杀虫剂较敏感，且响应速度很快，对其他毒性物质敏感性相对较弱[15，41]；费氏弧菌对毒物的响应时间较短，一般15～30 min即可给出结果，响应比较广谱，对部分毒物的响应阈值较高[15，42]。从以上分析比较可知，4类指示生物对毒物的响应时间、响应范围、响应程度及预警时间差异显著，其中最快预警的是发光菌，响应最灵敏的为溞类，响应范围最窄的为蛋白核小球藻[15]。

表8 4种不同营养级生物的响应阈值比较Tab.8 Comparison of response thresholds of four different trophic organisms mg/L

3 结 论

基于鱼类、溞类、藻类及发光菌4种不同营养级指示生物对不同污染物的响应比较研究可知：① 斑马鱼对大多数污染物都有响应，响应范围相对较广，响应阈值相对较高；大型溞对大多数污染物比较敏感，敏感度最强，响应阈值相对较低，响应时间相对较长；蛋白核小球藻对污染物响应比较窄，对除草剂外的其它污染物敏感性较弱；费氏弧菌对大多数污染物都有响应，响应比较广谱，响应很迅速，但对部分毒物的响应阈值较高。② 不同指示生物对不同污染物的响应有各自特征，响应范围、响应时间及响应阈值均不一，预警效果不一，单一指示生物难以全面、高效、准确预警污染物的毒性效应。③当前水体污染物类型逐渐呈现复杂化、多样化、毒性不确定性等特征，需运用多指标生物联合预警，充分发挥各指示生物优势，以期提高污染物预警准确率，从而为保障水质安全提供技术支撑。