不同虾的组织中氨基脲存在形态及含量分析

朱盼盼，孙海新，李兆新，邢丽红，孙晓杰，郑旭颖，张梦婷，王继耀，周朝生，孙德祥

(1.青岛大学生命科学学院，山东青岛266100；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，山东青岛 266071；3.青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东青岛 266237；4.浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州 325005；5.浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室和温州市海洋生物遗传育种重点实验室，浙江温州 325005；6.安徽省水产技术推广总站，合肥 230601)

呋喃西林属于硝基呋喃类药物，因抗菌谱广，耐药性好，曾经在水产养殖中广泛使用。研究发现氨基脲主要以蛋白结合态形式长期稳定存在，并通过食物链传递给消费者。结合态氨基脲在酸性条件下解离被人体吸收，进而危害健康。氨基脲对人体具有致诱变性和潜在的致癌性。游离态氨基脲存在周期短，对人体产生的危害低。1995年欧盟规定在动物源食品中不得检出呋喃类残留物，2003年欧盟规定氨基脲最大残留限量值为1 μg/kg，对于虾类规定在使用呋喃西林时，可食性组织中氨基脲最大残留限量为0.5 μg/kg。1993年美国禁止在动物源食品中使用呋喃唑酮药物，2004年美国食品和药品管理局(FDA)公布了进口动物源性食品中包括呋喃西林和呋喃唑酮等禁用药物名单。日本在2006年起规定禁止使用呋喃西林，氨基脲在虾肌肉中检测限为0.5 μg/kg。中国2002年颁布禁止使用呋喃西林，2005年将呋喃西林药物列入废止兽药目录。2019年我国规定虾肌肉中氨基脲最大残留限量为1 μg/kg。

研究表明在虾类水产品中氨基脲含量较高，尤以日本沼虾()和罗氏沼虾()最为突出。根据调查发现养殖过程中并未使用呋喃西林药物，因此探明虾类水产品中氨基脲本底含量问题对正确认识虾的食用安全性十分必要，对虾类养殖业意义重大。已有研究证明氨基脲来源广泛，除了使用呋喃西林药物代谢产生外，在食品加工过程中会产生氨基脲。使用偶氮二甲酰胺或者次氯酸均会产生氨基脲。虾类生物摄食的天然食物在体内可能转化为氨基脲，温度也是导致氨基脲产生的一个因素。氨基脲作为内源性物质普遍存在于虾类水产品中。

研究表明氨基脲在虾组织中存在结合态和游离态2种形态。研究表明，新鲜北海地区虾的甲壳组织中存在结合态的氨基脲，罗氏沼虾甲壳组织中结合态氨基脲占总氨基脲比例大于65%，日本沼虾甲壳中结合态氨基脲占总氨基脲比例为84.37%。在凡纳滨对虾肌肉组织中游离态氨基脲所占比例为95%，罗氏沼虾肌肉组织中游离态氨基脲占比为100%，日本沼虾肌肉组织中游离态氨基脲占总氨基脲比例为51.7%～69.11%。在日本沼虾的足、肝胰腺团、眼柄和鳃中游离态氨基脲占总氨基脲比例分别为20.99%、94.90%、54.70%、19.87%。虾类品种繁多，不同品种、不同地域、不同养殖条件下虾中氨基脲的存在形态和分布特征尚缺乏系统研究。本研究详细探讨了氨基脲在虾中的组织分布、存在形态、海水和淡水品种差异，以及湖泊和池塘生长环境的差异，为正确认识虾中氨基脲残留提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

人工养殖虾样品分别采自安徽省和青岛市的人工养殖池塘；野生虾样品分别采集于安徽省内的天然湖泊和青岛沿海海域。每个地点采集3个虾样本(=3)，每个样本按虾的大小体重不同采集不同的数量，日本沼虾()、罗氏沼虾()、克氏原螯虾()、秀丽白虾()、凡纳滨对虾()、脊尾白虾()、日本对虾()每150尾为一个样本。中国对虾()、鹰爪虾()、口虾蛄()每30尾为1个样本。采集的日本沼虾迅速放入液氮罐，并运到实验室。所有样品均未使用药物。样品信息见表1。

表1 虾样品品种、样品量及来源(n=3)Tab.1 Variety,sample quantity and source of shrimp

1.2 化学试剂

氨基脲盐酸盐(德国Dr.Ehrenstorfer公司)，内标物C,N-SEM(上海泰坦科技股份有限公司)；盐酸和磷酸氢二钾(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)、醋酸铵(色谱纯，北京伊诺凯科技有限公司)、2-硝基苯甲醛(色谱纯，生工生物工程股份有限公司)、甲酸(色谱纯，青岛海沃森生物科技有限公司)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)、乙酸乙酯(色谱纯，青岛腾岳海邦化工有限公司)。

1.3 设备

QTRAP®5500液相色谱-串联质谱仪(配ESI离子源，美国AB SCIEX公司)；分析天平(感量0.01 g，德国赛多利斯集团)；Vortex 2涡旋混合器(德国IKA公司)；IS-RDS3恒温振荡器(美国精骐有限公司)；Himac GR22G高速离心机(日本日立公司)；N-EVAP 112氮气吹干仪(美国Organomation 公司)；微量高速离心机(德国Sigma公司)；Gradient A10 Mill-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 氨基脲标准溶液

准确称取14.9 mg氨基脲盐酸盐标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，-18 ℃冷藏保存。使用时用甲醇逐级稀释，配制成1 μg/mL、100 ng/mL和10 ng/mL的标准溶液。

1.4.2 内标标准溶液

准确称取适量内标标准品C,N-SEM，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL的内标标准储备溶液。使用时用甲醇逐级稀释，配制成100 ng/mL的内标标准工作液。

1.5 样品前处理方法

1.5.1 样品制备

取虾类样品的甲壳、肌肉、鳃、肝胰腺、头胸部、眼柄组织，用均质机混匀，每个样本组织大于20 g，-80 ℃保存。

1.5.2 氨基脲总量的测定

样品组织中残留的硝基呋喃代谢物直接经酸解、衍生化后，LC-MS/MS测试虾中氨基脲总量。

(1)水解和衍生化

准确称取1 g样品于50 mL离心管中，加入内标标准工作液100 μL，涡旋混合1 min，再加入0.5 mol/L盐酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛150 μL，涡旋混合震荡90 s，置于恒温振荡器中37 ℃避光振荡16 h。

(2)提取和净化

取出离心管冷却至室温，加入1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液5 mL，调节pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋振荡90 s，4 000 r/min离心5 min，取上清液转移至10 mL试管中于40 ℃下氮气吹干。准确加入5%甲醇水溶液涡旋振荡溶解残留物，过0.22 μm滤膜，待测。

1.5.3 结合态氨基脲含量的测定

采用甲醇以及不同浓度的甲醇水溶液洗涤样品去除样品中游离态氨基脲。分别称取适量均质后的虾组织样品(甲壳、肌肉、鳃、眼柄、肝胰腺、头胸部)于50 mL离心管中，分别加入5 mL 50%甲醇/水溶液，涡旋混合50 s，超声提取5 min，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液。再依次加入5 mL75%甲醇/水溶液重复上述操作。洗涤后的样品采用1.5.2的方法进行处理，经LC-MS/MS测试，测得结合态氨基脲含量。

1.5.4 标准工作曲线的制作

分别准确移取10 ng/mL氨基脲标准工作溶液50、100、200μL，100 ng/mL标准工作溶液50、100、200 μL和1 μg/mL标准工作溶液50 μL于7个50 mL离心管中。除不加样品外，按照1.5.2的测定操作，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线。

1.5.5 色谱条件和质谱条件

色谱条件：色谱柱为Waters Xbridge C柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流动相A为0.002 mol/L醋酸铵溶液，流动相B为100%甲醇溶液，流动相梯度洗脱条件：0～0.5 min，90% A；0.5～4.0 min，90%～5% A；4.0～5.5 min，5% A；5.5～6.0 min，5%～90% A；6.0～7.0 min，90% A ；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃。

质谱条件：离子源为ESI源，正离子扫描；离子源温度为550 ℃，去溶剂温度为380 ℃，喷雾电压5 500 V，碰撞气压力：中等；气帘气：206.85 kPa；雾化气：241.33 kPa；去簇电压：80 V；辅助加热气：241.33 kPa；锥形气流：344.75 kPa。数据采集采用多反应监测模式(MRM)。所监测的目标离子分别为氨基脲209.0>166.0(碰撞能量11 eV)和C,N-氨基脲212.0>168.0(碰撞能量13 eV)。数据处理采用MultiQuant软件。

2 结果与分析

2.1 方法适用性评价

2.1.1 方法的准确度和精密度

实验对方法的适用性进行了验证，氨基脲平均回收率为74.3%～113.5%，精密度小于6.3%。

2.1.2 方法的线性范围与检测限

按1.4的方法配制标准工作液，经过液相色谱-串联质谱仪检测后，以浓度为横坐标，氨基脲峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果表明，氨基脲在0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为=-0001 075-0033 7，=0.999。

2.2 虾类产品中氨基脲总量、结合态氨基脲含量及其所占比例

虾类产品不同组织中氨基脲总量、结合态氨基脲含量及结合态氨基脲占氨基脲总量的比例见表2。

表2 虾产品不同组织中氨基脲总量和结合态氨基脲含量Tab.2 The contents of total semicarbazide and bound semicarbazide in different tissues of shrimp products μg/kg

表2结果显示，在淡水虾(日本沼虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和秀丽白虾)和海水虾(中国对虾、凡纳滨对虾、口虾蛄、鹰爪虾、脊尾白虾和日本对虾)的甲壳、眼柄、鳃组织中均检出氨基脲，氨基脲含量范围分别为(1.05±0.11)～(855.39±10.55) μg/kg、ND～(106.3±21.47) μg/kg、ND～(32.15±4.14) μg/kg。总体而言，不同组织中氨基脲浓度从高到低依次为：甲壳>眼柄>鳃>肌肉>头胸部>肝胰腺。

生长在湖泊和池塘淡水环境中的日本沼虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和秀丽白虾等的甲壳、眼柄和鳃中氨基脲范围分别为(9.13±1.07)～(855.39±10.55) μg/kg、(12.61±2.09)～(106.3±21.47) μg/kg、(3.24±0.06)～(32.15±4.14) μg/kg，海水环境中的中国对虾、凡纳滨对虾、口虾蛄、鹰爪虾、脊尾白虾和日本对虾等甲壳、眼柄和鳃中氨基脲范围分别为(1.05±0.11)～(9.90±1.09) μg/kg、ND～(2.83±0.16) μg/kg、ND～(4.78±1.33) μg/kg。本研究发现，淡水虾中甲壳、眼柄和鳃组织中氨基脲含量比海水虾相应组织中氨基脲含量高。

淡水虾可食组织肌肉中浓度范围为(1.88±0.90)～(16.94±0.14) μg/kg，均大于残留限量1.0 μg/kg，其中肌肉组织中结合态氨基脲浓度范围为ND～(4.89±0.15) μg/kg，结合态氨基脲占氨基脲总量的12.7～28.9%，而在海水虾肌肉中普遍未检出氨基脲(<0.1 μg/kg)。

结果表明，虾甲壳组织和眼柄组织中氨基脲主要以结合态形式存在，其结合态氨基脲所占比例超过50%，而肌肉、鳃、肝胰腺、头胸部组织中氨基脲主要以游离态形式存在，其结合态氨基脲所占比例均低于50%。

2.3 湖泊野生与池塘养殖的日本沼虾氨基脲含量特征

2.3.1 养殖和野生日本沼虾氨基脲总量对比分析

分别对养殖和野生日本沼虾不同组织中氨基脲的含量进行统计分析，结果见图1。

养殖池塘采集的日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织氨基脲含量范围分别为(521.61±10.43)～(855.39±10.55) μg/kg、(67.85±10.67)～(95.03±21.79) μg/kg、(11.45±2.27)～(32.15±4.14) μg/kg、(14.01±0.55)～(19.37±1.34) μg/kg、(7.66±0.79)～(15.56±3.13) μg/kg、(8.53±0.17)～(16.94±0.14) μg/kg，湖泊采集的日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织氨基脲含量范围分别为(312.97±21.28)～(404.08±12.43) μg/kg、(87.58±10.32)～(106.3±21.47) μg/kg、(7.60±0.89)～(18.77±1.14) μg/kg、(5.48±1.16)～(7.62±1.12) μg/kg、(11.19±1.13)～(14.32±3.15) μg/kg、(6.27±0.23)～(13.94±0.15) μg/kg。图1结果显示养殖池塘采集的日本沼虾甲壳、鳃、头胸部、肌肉组织氨基脲含量均高于湖泊采集的日本沼虾氨基脲含量。

图1 野生和养殖日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织中氨基脲含量Fig.1 Content of total semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle of wild and cultured M.nipponense

2.3.2 日本沼虾结合态氨基脲含量分析

分别对养殖和野生日本沼虾不同组织中结合态氨基脲的含量进行统计分析，结果见图2。

养殖池塘采集的日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织结合态氨基脲含量范围分别为(427.23±1.98)～(510.01±3.14) μg/kg、(53.75±4.13)～(81.02±11.89) μg/kg、ND～(1.01±0.02) μg/kg、ND～(3.58±0.14) μg/kg、未检出～(1.37±0.09) μg/kg、(1.71±0.06)～(4.89±0.15) μg/kg，湖泊采集的日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织结合态氨基脲含量范围分别为(256.67±10.16)～(340.8±4.57) μg/kg、(76.38±7.56)～(93.79±11.10) μg/kg、(0.74±0.09)～(6.88±1.08) μg/kg、(0.67±0.04)～(2.14±0.06) μg/kg、(0.36±0.13)～(2.93±0.64) μg/kg、(1.38±0.12)～(3.64±0.93) μg/kg。图2结果显示，养殖日本沼虾甲壳、头胸部、肝胰腺、肌肉组织结合态氨基脲含量均高于野生日本沼虾结合态氨基脲含量，在甲壳、眼柄组织中氨基脲主要是结合态形式存在，其它组织中氨基脲以游离态形式存在。

图2 野生和养殖日本沼虾甲壳、眼柄、鳃、头胸部、肝胰腺、肌肉组织中结合态氨基脲含量Fig.2 Content of bound semicarbazide in shell,eyestalk,gill,cephalothorax,hepatopancreas and muscle tissue of wild and cultured M. nipponense

3 讨论

本研究结果表明，在人工养殖环境和野生环境下虾中氨基脲含量存在一定差异，但其组织分布呈现相似的规律，不同组织中氨基脲含量从高到低依次为：甲壳>眼柄>鳃>肌肉>头胸部>肝胰腺。由于采样时间、地点等因素的差异，不同品种虾的不同组织氨基脲含量存在差异。另有研究表明，在蜂等昆虫的壳中存在氨基脲，氨基脲是昆虫壳组织的成分基团。以上研究均表明，氨基脲作为内源性物质在不同品种虾的甲壳组织中普遍存在，且含量最高。

氨基脲在虾不同组织中的存在形态也各不相同。宋蓓等研究日本沼虾不同组织中氨基脲存在形态，发现壳中氨基脲以结合态形式存在且所占比例大于50%，与本研究结果一致。甲壳、眼柄、鳃等虾的角质化组织中结合态氨基脲所占比例大于肌肉组织中结合态氨基脲的比例。由于甲壳类生物生长过程中具有脱壳行为，因此氨基脲在不同组织中的相关关系及转化、平衡机制有待深入研究。

来源于不同生长环境的虾组织中氨基脲含量存在差异。本研究通过对淡水虾和海水虾中氨基脲含量进行对比分析发现，氨基脲在中国对虾、凡纳滨对虾、口虾蛄、鹰爪虾、脊尾白虾和日本对虾等海水虾肌肉组织中小于0.1 μg/kg，在日本沼虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和秀丽白虾等淡水虾的可食性肌肉中含量较高，在日本沼虾、罗氏沼虾肌肉组织中平均含量均大于1.0 μg/kg，表明氨基脲主要存在于淡水环境生长的虾中。其它研究也表明在淡水中生长的虾肌肉组织中存在氨基脲，如来源于不同地区的克氏原螯虾肌肉组织中氨基脲含量分别为(0.52±0.03) μg/kg和4.2～12 μg/kg，说明不同生长环境下淡水虾中氨基脲含量也存在一定差异。上述研究表明，日本沼虾在不同环境条件下，其不同组织中氨基脲含量存在差异，这种差异可能与日本沼虾的养殖环境或饲料的影响的有关。水体、底泥或饲料中含有的氨基脲或氨基脲基团，亦或其它腐殖质对虾体内氨基脲含量的影响机制有待进一步研究。