恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的药代动力学研究

张国栋，刘永涛，艾晓辉，孙如玉，杜香璇

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141；4.湖北省水产品质量安全工程技术研究中心，武汉 430223)

异育银鲫()是一种利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育子代的鲫养殖新对象，具有生长快、个体大、抗逆性强等特点，在养殖生产中显示出良好的经济性状。斑点叉尾鮰()，属鲶形目鮰科，是我国1984年从美国引进的一种具有食性杂、生长快、适应性广、抗病力强、肉质上乘等优点的淡水养殖鱼类。随着高密度养殖和集约化程度的加剧，水产动物的各类暴发性疾病相继发生，给水产养殖业带来了严重的危害，其中各种细菌性疾病尤为突出，而抗菌药物被广泛用于治疗和预防这些细菌性疾病。

恩诺沙星是化学合成的第三代喹诺酮类广谱抗菌药物，在水产养殖中主要用来治疗细菌性疾病。目前，临床中常用的恩诺沙星剂型主要有粉剂、注射剂、溶液剂和混悬剂等。由于水溶性低，使其粉剂和溶液剂在动物口服给药中的应用和疗效受到了很大限制；而其注射剂在使用时需多次重复给药，对动物应激大，且注射给药也增加了集约化养殖场的劳动量；混悬剂不利于群体给药，增加了饲养管理成本等。本实验室研制的恩诺沙星乳具有溶解度高、稳定性好和抗菌活性强等特点，其在水产动物体内的代谢规律是制定给药方案的理论基础。恩诺沙星在水产动物体内药代动力学的研究较多，但有关恩诺沙星乳药代动力学的研究仅见罗非鱼()。因此，本研究旨在探讨恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内动力学与生物转化规律，并结合恩诺沙星药效学规律为恩诺沙星乳的安全合理用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

恩诺沙星标准品(纯度>99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氘代恩诺沙星(恩诺沙星-D)标准品(纯度>99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；环丙沙星标准品(纯度>95.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氘代环丙沙星(环丙沙星-D)标准品(纯度>95.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；恩诺沙星粉(纯度≥98.0%，山东鲁抗医药股份有限公司)；乙腈、甲酸、水、正己烷、甲醇(色谱纯，美国J.T.Baker公司)；盐酸(优级纯，东大化工股份有限公司)；无水硫酸镁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠(生物级，上海源叶生物科技有限公司)。恩诺沙星乳(5 mg/mL)是将0.5 g恩诺沙星粉溶解在5 mL的聚氧乙烯蓖麻油-40和1 mL的肉豆蔻酸异丙酯中，然后用蒸馏水稀释至100 mL，混合均匀至清澈透明。

1.2 仪器设备

TSQ Quantum Access Max高效液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher scientific公司)；AE-240精密电子天平(美国METTLE-TOLEDO公司)；20PR-520自动高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；SK40-120DJ超声仪(张家港市神科超声电子有限公司)；HQ-60涡旋混合器(北方同正生物技术发展有限公司)；KD200氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.3 实验动物

异育银鲫，平均体重为(127.56±14.25) g和斑点叉尾鮰，平均体重为(147.17±23.58) g均采购自湖北荆州某养殖场，在长江水产研究所窑湾试验基地室内暂养并进行试验。将鱼放置于已清洗并用高锰酸钾消毒的玻璃水族箱(规格1 000 mm×578 mm×690 mm)中，试验用水为充分曝气的自来水，24 h不间断充气增氧，并用加热棒调节水温，控制水温在(25±1) ℃，及时清除水体残饵和排泄物，试验期间鱼成活率在99%以上。

1.4 给药及样品采集

异育银鲫和斑点叉尾鮰单剂量口灌恩诺沙星乳(10 mg/kg bw)，并在给药后的0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h自尾静脉采血样，每个时间点采样6尾，从尾静脉采集血液样品，装于用1%肝素钠溶液润洗的离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 样品前处理

在室温下，将冷冻样品自然解冻。准确量取血浆1 mL于10 mL离心管中，加入浓度为1 μg/mL的恩诺沙星-D和环丙沙星-D溶液各25 μL。然后在样品中加入4 mL酸化乙腈(乙腈∶盐酸∶水=2 500∶10∶10)，涡旋混合30 s，再加入0.5 g无水硫酸镁，涡旋混合30 s，8 000 r/min离心5 min，将上层提取液吸至另一10 mL离心管中。重新加入4 mL酸化乙腈提取残液，将提取液合并在一起。50 ℃氮气吹干，用1 mL 20%甲醇水溶液复溶，加入1 mL正己烷旋涡混合30 s去脂，8 000 r/min离心5 min，取1 mL下层溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后上机检测。

1.6 色谱条件和质谱条件

1.6.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液∶乙腈=80∶20(V∶V)；流速为0.2 mL/min；进样量10 μL。

1.6.2 质谱条件

离子源：加热电喷雾电离子源(HESI)；离子化模式：正离子模式；扫描方式：选择离子反应监测模式(SRM)；喷雾电压：3 500 V；蒸发器温度：350 ℃；鞘气(高纯氮气)压力：40 kPa；辅助气(高纯氮气)压力：8 kPa；离子传输毛细管温度：330 ℃；恩诺沙星、恩诺沙星-D、环丙沙星和环丙沙星-D质谱参数，见表1。

表1 恩诺沙星、恩诺沙星-D5、环丙沙星和环丙沙星-D8质谱条件Tab.1 Mass spectrometry parameters of enrofloxacin，enrofloxacin-D5，ciprofloxacin，and ciprofloxacin-D8

1.7 标准曲线的制备

标准储备液的制备：分别准确称取10 mg的恩诺沙星标准品、恩诺沙星-D标准品、环丙沙星标准品和环丙沙星-D标准品，以适量色谱纯乙腈溶解并定容至100 mL，配制成浓度均为100 mg/L的标准储备液，-20 ℃保存备用。

标准曲线的制备：以标准储备液为基础，配制含恩诺沙星-D内标和环丙沙星-D内标均为25 μg/L，恩诺沙星和环丙沙星浓度均为1、5、10、50、250、500和1 000 μg/L的标准曲线，作HPLC-MS/MS分析，分别以测得的恩诺沙星与恩诺沙星-D和环丙沙星与环丙沙星-D峰面积的比值为纵坐标，恩诺沙星和环丙沙星的浓度为横坐标，计算回归方程和相关系数。

1.8 回收率、精密度和检出限

在异育银鲫和斑点叉尾鮰空白血浆中分别添加4个浓度水平的标准溶液，使血浆中恩诺沙星和环丙沙星的质量浓度分别为2、5、50和500 μg/L，恩诺沙星-D和环丙沙星-D的质量浓度分别25 μg/L，每个浓度6个平行，并设1个空白对照，按样品前处理过程处理后测定回收率。每个浓度的样品，一天内重复测5次，并一周内重复测5次，计算日内及日间精密度。根据6个空白样品基线噪声的平均值和S/N=3、S/N=10分别计算方法的检出限和定量限。

1.9 数据处理

标准曲线采用Microsoft Excel 2019进行计算；恩诺沙星和环丙沙星的药-时曲线采用Prism 8.0进行绘制；动力学参数采用WinNonlin 8.1软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 分析方法验证

在1～1 000 μg/L质量浓度范围内，恩诺沙星和环丙沙星的标准曲线方程分别为=0019+0040和=0021+0090，相关系数分别为0.999 3和0.999 5。血浆中恩诺沙星和环丙沙星的检测限为1.0 μg/L，定量限为2.0 μg/L。在本实验条件下，恩诺沙星和环丙沙星在血浆中的回收率在94.23%～117.47%。日内精密度和日间精密度均小于10%，见表2。本方法可用于测定异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中恩诺沙星和环丙沙星的浓度。

表2 恩诺沙星和环丙沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的回收率和精密度(n=6)Tab.2 Recovery and precision for enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus(n=6)

2.2 恩诺沙星和环丙沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的药-时变化规律

恩诺沙星和环丙沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的药-时曲线分别见图1和图2。给药0.5 h后，恩诺沙星的血药浓度分别为1.20 μg/mL和1.01 μg/mL。随后药物浓度逐渐上升，直至6 h和8 h血药浓度达到峰值4.66 μg/mL和3.95 μg/mL。达峰之后药物浓度逐渐下降，168 h后仍能检测到，浓度分别为0.048 μg/mL和0.054 μg/mL。血浆中环丙沙星水平在给药后呈快速上升，异育银鲫和斑点叉尾鮰的血药浓度都在12 h达到峰值53.17ng/mL和32.24 ng/mL。值得注意的是，环丙沙星在给药后的48 h和96 h出现了一个小的上升，即双峰现象。随后又继续迅速下降，168 h后仍能检测到，浓度分别为8.06 ng/mL和2.87 ng/mL。

图1 恩诺沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的药-时曲线Fig.1 Concentration-time curve of enrofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus

图2 环丙沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的药-时曲线Fig.2 Concentration-time curve of ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus

2.3 恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的药动学规律

采用WinNonlin软件的非房室模型的统计矩原理分析异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的药物动力学特征，药代动力学参数见表3。恩诺沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的达峰浓度()分别为4.66 μg/mL和3.95 μg/mL；相应的达峰时间()分别为6 h和8 h；分布容积()分别为1.27 L/kg和1.68 L/kg；消除半衰期(1/2)分别为20.05 h和22.06 h；药时曲线下面积()分别为228.26 μg·h/mL和189.55 μg·h/mL；平均驻留时间()分别为42.87 h和43.48 h；消除速率()分别为0.035 h和0.031 h。其主要代谢产物环丙沙星的分别为0.053 μg/mL和0.043 μg/mL；相应的均为12 h；分别为125.95 L/kg和134.00 L/kg；1/2分别为45.79 h和31.66 h；分别为5.24 μg·h/mL和3.40 μg·h/mL；分别为78.17 h和63.66 h；分别为0.015 h和0.022 h。

表3 异育银鲫和斑点叉尾鮰单次口灌10 mg/kg体重的恩诺沙星乳后血浆中恩诺沙星和环丙沙星的药代动力学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameter of enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus after oral administration(10 mg/kg bw)

3 讨论

3.1 恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的动力学参数

水产动物体内的药代动力学易受机体因素、药理因素和环境因素的影响。因此，研究不同条件下的药动学对药物的合理使用有重要的指导作用。和是评价药物在体内吸收速率的重要参数。以10 mg/kg bw的单剂量对罗非鱼口灌恩诺沙星乳后，恩诺沙星在体内的为4.38 μg/mL，对应的为2 h；而4倍给药剂量造成的恩诺沙星粉在罗非鱼体内的仅为3.47 μg/mL，对应的为1 h。说明恩诺沙星乳在罗非鱼体内吸收较好，不同可能是温度和给药剂量的影响。本试验条件下，恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的分别为4.66 μg/mL和3.95 μg/mL，对应的分别为6 h和8 h。恩诺沙星乳在异育银鲫血浆中的大于恩诺沙星粉在鲫()血浆中的(3.24 μg/mL)，进一步说明恩诺沙星乳在水产动物体内吸收较好。恩诺沙星乳在异育银鲫血浆中的大于斑点叉尾鮰，且快于斑点叉尾鮰，说明恩诺沙星乳在异育银鲫体内吸收比斑点叉尾鮰好。是表示药物吸收程度，决定生物利用度的重要参数。恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的分别为228.26 μg·h/mL和189.55 μg·h/mL，均高于罗非鱼(157.21 μg·h/mL)、鲫(162.72 μg·h/mL)和鲤()(45.055 μg·h/mL)。进一步说明恩诺沙星乳在水产动物体内吸收好，生物利用度高。是反映药物在体内分布的范围大小和特性的重要参数。本试验条件下，恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的分别为1.27 L/kg和1.68 L/kg，与在罗非鱼血浆中的6.53 L/kg差别较大，这可能是因为种属差异引起的。恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的均大于1.0 L/kg，说明恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内分布广泛，且在斑点叉尾鮰体内分布大于异育银鲫。1/2和是反映药物在体内消除的主要参数。恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中的1/2分别为20.05 h和22.06 h，均小于恩诺沙星粉在鲫、罗非鱼、大黄鱼()体内的62.17 h、212.8 h和30.484 h；分别为42.87 h和43.48 h，小于恩诺沙星粉在欧洲鳗鲡()和大西洋鲑()幼鱼血浆中的161.1 h和151.7 h。这种差异可能是因为剂型和种属差异引起的。同时说明了恩诺沙星乳在异育银鲫体内消除比斑点叉尾鮰快。

3.2 恩诺沙星乳在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内的生物转化

在许多动物物种中，恩诺沙星主要脱乙基化为环丙沙星。哺乳动物中环丙沙星和恩诺沙星的比率为20%～55%。在水生动物中，恩诺沙星转化为环丙沙星的速度明显低于哺乳动物，这是由于水生动物体内温度较低且易受外界环境的影响，从而影响了鱼类的新陈代谢。罗非鱼口灌给药后血浆中环丙沙星和恩诺沙星的比值为5.04%；大口黑鲈()给药后血浆中的环丙沙星和恩诺沙星的比值为2.73%；鲫在分别肌肉注射和口灌给药后，血浆中环丙沙星和恩诺沙星的比值分别为2.17%和2.03%。本试验条件下，异育银鲫和斑点叉尾鮰体内检测到环丙沙星的分别为0.053 μg/mL和0.043 μg/mL，是恩诺沙星的1.14%和1.09%。异育银鲫和斑点叉尾鮰血浆中环丙沙星和恩诺沙星的比值分别为2.07%和1.74%，均小于鲫、罗非鱼和大口黑鲈。说明恩诺沙星在异育银鲫和斑点叉尾鮰体内代谢成环丙沙星的量很少，且异育银鲫将恩诺沙星转化为环丙沙星的能力较斑点叉尾鮰稍强。

3.3 恩诺沙星乳的给药方案

临床水产养殖用药中的最低有效血药浓度是指该药物对常见致病菌的最小抑菌浓度(MIC)。马寅等测得恩诺沙星对常见的致病弧菌的MIC为0.1～0.8 mg/L。喹诺酮类药物通常被认为具有浓度依赖性的杀菌活性，/MIC>8和/MIC>125一般被认为是获得临床成功和避免细菌耐药性的关键。SHAN等通过对异育银鲫分别口灌和注射10 mg/kg bw单剂量的恩诺沙星溶液，发现其分别对MIC≤0.28 μg/mL和MIC≤0.40 μg/mL的病原菌有较好的治疗效果。本实验中，10 mg/kg bw单剂量的恩诺沙星乳适用于恩诺沙星对异育银鲫和斑点叉尾鮰病原菌MIC分别小于0.58 μg/mL和0.49 μg/mL的病原菌。