D-阿洛酮糖 3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

胡梦莹，李梦丽，江波，张涛

(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)

国际稀有糖协会将自然界中很少存在的单糖和糖醇定义为稀有糖，D-阿洛酮糖就是其中的一种，它是D-果糖在C-3位上的差向异构体[1]，早在2014年就被美国食品药品监督管理局列为一般安全，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中[2]。D-阿洛酮糖具有许多有益人体健康的特殊功能[3]，例如摄入适量的D-阿洛酮糖可以降低血糖血脂水平[4]、减少脂肪堆积[5]、清除活性氧[6]的活性等。且当人体摄入D-阿洛酮糖后，生成的热量较低，仅为同等质量蔗糖的0.3%[7]，因此被美国食品导航网评为最具潜力的蔗糖替代品。

目前D-阿洛酮糖的生产主要依赖于酶法生产，这主要是因为其在自然界中含量稀少，直接提取不符合经济效益，而化学合成法会产生副产物，增加生产成本[8]。而酶法生产中最关键的酶是D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)，它可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。野生型菌株的产酶量远远低于预期，无法应用于工业生产中，因此，有必要构建合适的表达载体并在异源生物中表达。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌[9]，具有较为清晰的研究背景[10]，发酵周期短、分泌能力强且是食品级安全菌株，是一个较好的表达宿主[11]。

本研究中将ClostridiumscindensATCC 35704来源的DPE，在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB800中进行异源表达，通过筛选单启动子/串联启动子，优化核糖体结合位点序列，从而提高DPE的表达量，为DPE生产应用于食品行业提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、B.subtilisWB800为实验室保藏；穿梭质粒pP43 NMK由实验室保存；质粒PUB-dpe由实验室前期构建而成[12]。

1.1.2 试剂

Phanta Max Super-Fidelity DAN Polymerase、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit、质粒快速抽提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；超级感受态细胞制备试剂盒、细菌DNA基因组提取试剂盒、4S Green Plus无毒核酸染料、琼脂糖、50×TAE 缓冲液，上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、10×Loading Buffer，TaKaRa(大连生物有限公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒、蛋白质marker，5×蛋白上样缓冲液，上海雅酶生物医药科技有限公司；葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨及其他常用试剂，国药集团。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃高压灭菌20 min(固体中需额外添加20 g/L琼脂)。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨10，酵母浸粉20，NaCl 8，Na2HPO4·12H2O 1，MgSO4·7H2O 1，调节pH至7.0，115 ℃高压灭菌30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的设计

本文所用的引物如表1所示，由苏州金唯智生物科技有限公司所合成。

表1 本研究中涉及的所有引物

1.2.2 pP43 NMK-promoter-DPE单启动子表达质粒的构建及克隆

利用不同启动子的引物对Promoter-F/R(表1)，以B.subtilis168基因组为模板，通过PCR技术扩增得到启动子PamyE、PaprE、PgsiB、Phag、PnprE、P43、PsigX、PylbP片段，以实验室保存的质粒PMA5为模板，通过PCR技术扩增得到启动子PHpaII片段。以实验室保存的质粒PUB-DPE为模板，利用不同的引物对DPE(prometer)-F/DPE-R，通过PCR技术扩增得到DPE片段。其中引物Promoter-R与引物DPE(promoter)-F有15～20 bp的同源臂，利用重叠PCR可将Promoter片段与DPE片段进行融合，形成新片段Promoter-DPE。产物经琼脂糖凝胶电泳和胶回收，在-20 ℃保存。以实验室保存质粒pP43 NMK为模板，利用引物对P-F/R，去除原有启动子序列，进行PCR线性化扩增。其中引物Promoter-F、DPE-R分别与引物P-R、P-F有15～20 bp的同源臂，通过ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒，将Promoter-DPE片段和线性化pP43 NMK片段环化后构建含不同单启动子的载体pP43 NMK-promoter-DPE。

通过超级感受态细胞制备试剂盒制备E.coliDH5α感受态细胞，并按照说明书方法将pP43 NMK-promoter-DPE转化至E.coliDH5α感受态细胞，将重组细胞涂布在LB 氨苄(100 mg/L)抗性固体平板上，37 ℃过夜培养，挑取转化子，筛选验证测序。将测序验证正确的质粒pP43 NMK-promoter-DPE转至B.subtilisWB800感受态细胞，将重组细胞涂布在LB卡那(50 mg/L)抗性固体平板，37 ℃过夜培养，挑取转化子，测序正确后即得到重组菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE。

1.2.3 pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE串联启动子表达质粒的构建及克隆

以1.2.2中构建的含有不同单启动子pP43 NMK-promoter-dpe质粒为模板，利用引物对P-F、Promoter1(promoter2)-R，通过PCR技术扩增pP43 NMK-Promoter1片段，利用引物对(promoter1)Promoter2-F、DPE-R，通过PCR技术扩增Promoter2-DPE片段，其中引物P-F、Promoter1(promoter2)-R分别和引物DPE-R、(promoter1)Promoter2-F有15～20 bp的同源臂，通过ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒，将pP43 NMK-Promoter1片段和Promoter2-DPE片段环化后构建含不同串联启动子的载体pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

按照1.2.2中的转化方法，最后得到重组菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

1.2.4 RBS序列的优化

文献[13]报道绝大多数细菌中有着通用的SD序列(shine-dalgarno sequence，SD)GGAGG。本文中待优化的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)同样具有该SD，以此作为RBS序列的种子区域，突变前两个与后两个碱基。报道中的RBS序列里A、G碱基出现频率较高[14-16]，因此将前后两个碱基在A/G中随机出现，得到包括对照RBS序列在内的16种RBS序列。

1.2.5B.subtilisWB800重组菌株的发酵培养与表达

用接种环在LB卡那抗性平板上划线，37 ℃培养12 h，挑取单菌落接种至LB培养基中，37 ℃，200 r/min摇床培养12 h。将活化后的种子液按3%的接种量接种至发酵培养基中，37 ℃，200 r/min摇床培养，定时取样，检测菌体生长OD600值和DPE酶活力。

1.2.6 酶活力的检测

吸取1 mL发酵液，4 000 r/min离心5 min，弃上清液，保留菌体沉淀。用50 mmol/L，pH 7.5的Tris/HCl缓冲液反复吹洗菌体沉淀后，将其稀释至合适浓度。取一定量稀释后的发酵液，加入到终体积为1 mL 的果糖底物溶液中(50 mmol/L，pH 7.5的Tris/HCl 缓冲液配制，质量浓度100 g/L)，55 ℃，反应10 min后，高温煮沸灭酶。将样品于12 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm 滤膜，制样，利用HPLC检测分析。

其中HPLC的检测条件为：Waters e2695高效液相，流动相为超纯水(添加50 mg/L EDTA钙盐，超声15 min)，流速0.4 mL/min；Sugar pak-1钙型色谱柱，柱温85 ℃；示差折光检测器，检测器温度30 ℃。

酶活力定义：在55 ℃，pH 7.5的条件下，单位时间(min)生成1 μmolD-阿洛酮糖所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 不同启动子重组菌株的构建

利用表1中的引物，对各个启动子进行PCR扩增，启动子片段带有相应的上下游同源臂序列，其PCR产物电泳结果如图1 所示，可知启动子片段大小与预期一致。当单启动子重组菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE构建完成后，用质粒快速抽提试剂盒抽取该菌株质粒，以其为模板，按照1.2.3中的方法，构建串联启动子重组菌株pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE，其中pP43 NMK-Promoter1片段和Promoter2-DPE片段PCR产物电泳结果见图1，其大小与预期一致。待转化子测序无误后，即可获得重组菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-promoter-DPE和pP43 NMK-promoter1-promoter2-DPE。

a-Promoter片段PCR扩增；b-Promoter2-DPE片段PCR扩增；c-pP43 NMK-Promoter1片段PCR扩增

2.2 单启动子对重组菌株表达水平的影响

靶基因的有效转录是蛋白表达的第一步，启动子在基因组中是重要的调控元件，能够决定基因表达的时间和强度[17]。为了进一步提高DPE的表达效果，构建了9种启动子介导的DPE重组表达菌株，并对其进行发酵产酶，其最大酶活力如图2所示。本文选用的启动子均为枯草芽孢杆菌中表达效果较好的启动子，由图2和图3可知，在发酵产DPE时，不同启动子介导的DPE表达效果差异较大，但启动子对菌体的生长情况影响较小，其酶活力最高时OD600值差异较小。其中最优单启动子为Phag，相应重组菌株酶活力高达19.62 U/mL，OD600值为12.03，其次是启动子PylbP和P43，对应的酶活力分别为16.62 U/mL和15.05 U/mL，OD600值分别是11.87和11.31。Phag由σD识别，在枯草芽孢杆菌中σD涉及鞭毛基因、运动性基因和自溶素基因及其调节因子的表达。在所选启动子中，PsigX是P43强度的3.03倍[18]，但在DPE的表达中，效果较差。这些结果表明启动子和目的基因之间存在着一定的适配性，强度大的启动子表达效果不一定好，需要进行不断的筛选，找出最适启动子。

图2 不同单启动子重组菌株酶活力及OD600值

M-250 kDa 蛋白 Marker；1-amyE；2-aprE；3-gsiB；4-hag；5-HpaⅡ；6-nprE；7-P43；8-sigX；9-ylbP；10-对照

2.3 串联启动子对重组菌株表达水平的影响

选取启动活性较高的3个启动子Phag、PylbP和P43进行下一步研究。将这3个启动子进行两两/重复串联，通过构建串联启动子介导的DPE重组表达菌株，研究串联启动子对DPE表达的影响，同时交换被串联的两个启动子顺序，研究启动子的位置对DPE表达的影响，其最大酶活力及SDS-PAGE分析分别如图4与图5所示。大部分启动子经过串联以后，酶活力反而有所降低，推测是因为所筛选的单启动子均为启动强度较强的启动子，当它们被串联时，会彼此形成干扰或竞争，反而使表达水平有所降低[19]。少部分启动子经过串联以后，酶活力有了提升，如PylbP-ylbP，但其最大酶活力依然低于单启动子Phag。同时，改变被串联的两个启动子的顺序，酶活力也随之有了较明显的改变，这说明启动子内部核心序列的位置，对目的基因的表达影响较大，通常而言，与目的基因相邻的启动子，其强度对串联启动子的转录活性影响更大[20]。此外，吴凤依[19]构建了串联启动子PP43-hag介导的重组菌株表达脂肪酶A，其表达效果最好，但对于本文的DPE而言，PP43-hag介导的重组菌株表达效果反而较差，这同样证明启动子和目的基因之间存在着一定的适配性。另外，与单启动子介导的重组菌株相比，串联启动子介导的重组菌株在酶活力最高时，其整体OD600值的范围要略低一些，推测是因为双启动子介导时，对重组菌株的生长造成了一定的胁迫，这也是串联启动子介导的重组菌整体酶活力较低的一个原因。

图4 不同串联启动子重组菌株酶活力及OD600值

M-250 kDa 蛋白 Marker；1-hagP43；2-P43 hag；3-ylbPhag；4-hagylbP；5-ylbPP43；6-P43ylbP；7-P43P43；8-ylbPylbP；9-haghag；10-对照

以上结果同样也表明，将两个启动活性较高的启动子串联，不一定能够继续增强串联启动子的活性。

2.4 RBS序列对重组菌株表达水平的影响

RBS序列即核糖体结合位点，决定着翻译水平的高低，是蛋白表达的关键区域[21]。它位于起始密码子AUG上游约8～13核苷酸处，是一段富含嘌呤的非翻译区，可以与核糖体16S rRNA互补配对并与之结合，从而控制翻译的起始。经过筛选，发现单启动子Phag介导的重组菌株在表达DPE时效果最好，因此以启动子Phag的RBS序列为对象，GGAGG序列为RBS种子区域，对其前后两个共计4个碱基进行随机A/G突变，旨在提高目的蛋白的表达。RBS序列中具体突变序列如图6所示，突变后的重组表达菌株酶活力及OD600值见图7。RBS序列突变后，大多数重组菌株的酶活力得到了显著提升，其中重组菌株B.subtilisWB800/pP43 NMK-hag-R4-dpe的酶活力最高，为25.39 U/mL，OD600值为11.65，较突变前酶活力提高了29.4%。同时，在各突变菌株酶活力最大时，其OD600值相差不大，说明突变对菌株的生长情况影响较小。

图6 RBS序列不同突变位点

R0-原始对照菌株，R1～R15-RBS突变菌株(突变序列如图6所示)

3 结论

本文分别构建了9株单启动子和9株双启动子介导的DPE表达的重组菌株，其中单启动子Phag介导的重组菌株经摇床发酵后，最大酶活力高达19.62 U/mL，是P43介导的原始菌株酶活力的1.3倍，是枯草芽孢杆菌常用启动子PHpaII介导的重组菌株的1.77倍。然后通过RBS序列优化，构建了15株重组菌株，使其酶活力再次提高了29.4%，是原始菌株酶活的1.69倍，是PHpaII介导的重组菌株的2.29倍。综上所述，本研究为DPE工业化生产提供了方法学参考，后续可对其进行发酵优化，进一步提高其表达水平。