赛里木酸奶细菌多样性及挥发性风味物质成分分析

2022-10-04王子涵林青刘钰洁秦新政李月娄恺袁华伟霍向东

食品与发酵工业 2022年18期

王子涵，林青，刘钰洁，秦新政，李月，娄恺，袁华伟*，霍向东*

1(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐,830052)2(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，新疆乌鲁木齐,830091)3(宜宾学院，质量管理与检验检测学部/固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾,644000)4(新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐,830054)

赛里木酸奶是新疆阿克苏地区拜城县赛里木镇维吾尔族农家采用传统方法制作的一种发酵乳制品，集鲜明的地域和民族特色为一体，是南疆特色乳品的代表[1]。赛里木酸奶气味清香、酸甜可口、质地黏稠，能拉出近1 m长的丝，有“拉丝酸奶”之称[2]。

近年，对赛里木酸奶的研究多数集中在菌株的分离鉴定、发酵工艺、生物活性物质及主体风味分析[2-5]。对原产地赛里木酸奶高通量测序结果表明，厚壁菌门是其优势细菌门，乳杆菌属为优势细菌属[1]。利用分离自赛里木酸奶的单株乳酸菌或复合菌发酵牛奶后，检测出11种挥发性成分，其中乙醇、乙酸乙酯和3-羟基-2-丁酮是主体风味物质[2]。赛里木酸奶属自然菌群发酵产品，菌种构成复杂，全面评判其主体发酵菌群及风味物质，还需要深入研究。

本文以赛里木酸奶引子为发酵剂，采用当地传统工艺，制作赛里木酸奶，结合高通量测序及顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(head space solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)联用技术，解析赛里木酸奶细菌群落结构多样性及挥发性风味物质组成，旨在为新疆特色发酵乳中优势功能菌的分离筛选及发酵剂的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

纯牛奶，利乐枕包装，新疆西域春公司；Gene JET胶回收试剂盒，Thermo Scientific公司；D2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司；带识别条码(barcode)的细菌16S rRNA基因V3～V4区扩展引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)，北京诺禾致源生物信息科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

PCR仪，美国Bio-Rad公司；Illumina NovaSeq 高通量测序平台，美国Illumina公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头及萃取手柄，上海安谱实验科技股份有限公司；TQ8040 NX三重四极杆型气质联用仪，日本SHIMADZU公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Fresco17离心机，Thermo Fisher Scientific公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，北京六一生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

原产地赛里木酸奶样品的采样地点为新疆拜城县赛里木镇托喀其买里村，赛里木酸奶制作传承人吐热汗·吐热甫工作室。使用经灭菌后的50 mL离心管进行分装，每管30 mL左右，采集6管，1管用于高通量测序，1管用于后续试验，4管作为备份，放入车载低温冰箱保存。

1.2.2 赛里木酸奶发酵工艺流程

传统赛里木酸奶主要有5道制作工序:

挤奶→煮奶→盛碗→添加引子(发酵剂)→发酵(8 h)→成品

每次制作酸奶后都要留下一些引子供下次发酵用。据此，本研究采用如下工艺：

纯牛奶(西域春利乐枕)→分装→预热(42 ℃)→接种[加入赛里木酸奶引子，接种量4%(体积分数)]→发酵(42 ℃，8 h)→冷藏(4 ℃)

用于挥发性风味物质HS-SPME-GC-MS的检测。

1.2.3 高通量测序

采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTMAB)溶解细胞膜的方法提取赛里木酸奶中的总DNA[6]。使用带Barcode引物和高效高保真的酶，对细菌16S rDNA的V3～V4区域(引物 338F/806R)进行 PCR 扩增[7]。

PCR反应体系(30 μL)：15 μL Phusion Master Mix(2×)，3 μL Primer(2 μmol/L)，10 μL(5～10 ng)DNA(1 ng/μL)，2 μL双蒸水；反应程序：98 ℃，1 min，(98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s)×30，72 ℃，5 min。PCR产物使用2%(质量分数)琼脂糖凝胶进行电泳检测。选择大小在400～450 bp的条带，切胶回收纯化。送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司，借助Illumina NovaSeq平台及相关资源完成高通量测序，并返回原始序列。

1.2.4 生物信息学分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，使用FLASH软件对样本的reads进行拼接，过滤处理得到高质量的Tags数据[7]。参照QIIME的Tags质量控制流程，与物种注释数据库比对，剔除质量较差的的嵌合体序列，最终得到有效序列[8]。利用UPARSE软件以97%的一致性将序列聚类为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)[9]。用MOTHUR方法与SSUrRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释分析，获得分类学信息并分别在各个分类水平上的群落结构进行统计分析[10]。通过QIIME软件进行Alpha多样性指数分析。

1.2.5 纯牛奶及酸奶样品中挥发性成分的提取

采用HS-SPME方法，称取20.00 g样品，放入100 mL带有硅胶垫帽的顶空萃取瓶中，立即密封，于60 ℃水浴中预平衡15 min后，推出老化过的萃取头，顶空吸附40 min。取出萃取针头后进样，250 ℃解析5 min。

1.2.6 GC-MS分析条件

GC条件：InertCap WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：进样口温度为250 ℃，初始温度为35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；进样模式：不分流进样；色谱柱流速：1 mL/min。

MS条件：电离方式EI；载气为He；离子源温度230 ℃；数据采集方式Q3 Scan；扫描范围45～500m/z。

1.2.7 相对气味活度值(relative odor activity value，ROAV)计算及关键风味物质的确定

ROAV值是一种能够有效评价测得化合物的方法[11]，挥发性成分阈值见参考文献[12-13]。定义样品总体气味贡献最大化合物的ROAV值为100，其他风味化合物的ROAV按公式(1)计算：

(1)

式中：Ci和Ti分别为各挥发性物质的相对含量和阈值;Cmax和Tmax分别为对样品总体风味贡献最大组分的相对含量和阈值。

2 结果与分析

2.1 赛里木酸奶中Alpha多样性分析

赛里木酸奶样品高通量测序返回原始序列58 475条，最终用于后续分析的有效序列有39 457条。采用Alpha多样性指标中表示群落多样性的Shannon指数、Simpson指数，表示物种丰富度的Chao1指数、Ace指数以及群落覆盖度指数Coverage[10]。对样品中群落多样性和物种丰度进行评估，结果如表1所示。样品的OTUs覆盖率达99.99%，说明样品中细菌种类几乎都能被检测到，测序结果可靠。OTUs数量越多说明样品中的细菌丰度越高，赛里木酸奶样品中共检测到186个OTUs，隶属于9门、17纲、34目、58科、77属。

表1 赛里木酸奶中细菌Alpha多样性指数

2.2 赛里木酸奶中细菌群落结构组成分析

对赛里木酸奶样品的有效序列进行聚类，以97%相似性度水平聚类的OTUs进行深度分析，将平均相对丰度>1%定义为优势微生物，平均相对丰度>10%定义为绝对优势微生物[10]。16S rDNA门水平上检测到9个菌门(图1)，厚壁菌门(Firmicutes)为绝对优势菌门，占比97.45%，其次为拟杆菌门(Bacteroidota)占比0.74%，其他门丰度小于0.5%；共检测出77个属，赛里木酸奶样品中占比最高的前10个属(图2)，链球菌属(Streptococcus)占比82.94%为绝对优势菌，其次为占比5.19%的乳杆菌属(Lactobacillus)。

图1 门水平上赛里木酸奶样品的细菌群落组成

2.3 赛里木酸奶挥发性风味物质成分分析

采用HS-SPME-GC-MS对纯牛奶及赛里木酸奶的挥发性成分进行定性和定量分析，结果如表2所示。两种样品共检测出46种成分，包含酸、醛、酮、酯、醇、醚、酚、呋喃、烷烃和芳香族化合物。纯牛奶共检测出26种成分，其中酸类5种，醛类5种，酮类5种，酯类3种，醇类1种，醚类1种，酚类1种，呋喃类2种，烷烃及其他衍生类种。赛里木酸奶共检测出31种成分，其中酸类10种，醛类1种，酮类5种，酯类5种，醇类4种，醚类1种，烷烃及其他衍生物4种，芳香族化合物1种。与纯牛奶相比，赛里木酸奶中酸、酯、醇类化合物种类及含量明显增加，醛类明显减少，酮类含量减少但种类发生改变，减少了酚类、呋喃类化合物，增加了芳香族化合物；其中，酸类占总比例最大，为47.57%，其次是酮类及醇类，分别占21.31%、12.83%。酯类化合物在检测结果中质量分数较低，但由于其香味阈值低，故对发酵乳风味的形成影响较大[14]。

2.4 根据相对气味活度值鉴定赛里木酸奶中主体风味物质

酸奶的整体风味是多种物质协同作用的结果，计算样品中挥发性成分的ROAV值确定赛里木酸奶中的主体挥发成分，ROAV越大表示该化合物对样品总体气味的贡献作用越大，一般认为ROAV>1的风味化合物是关键风味化合物，1≥ROAV>0.1的风味化合物起修饰作用[11]。如表3所示，纯牛奶中有5种特征成分，分别为2-甲基丁醛、糠醇、癸醛、2-甲基丙醛、壬醛；2种修饰性成分为2-壬酮和2-庚酮。赛里木酸奶中有11种关键成分，分别为甲基乙酰甲醇(乙偶姻)、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯；2种修饰性成分为5-羟基癸酸-δ-内酯和正癸酸。

3 讨论

本研究采用高通量测序对赛里木酸奶中细菌群落组成进行分析，发现Streptococcus占比82.94%为绝对优势菌属，能产生不同荚膜多糖和黏液多糖[15]，Lactobacillus占比5.19%，为优势菌属，可产生葡聚糖[16]。乳酸菌胞外多糖通过结合大量水或与酸奶中的其他成分相互作用而具有增稠、乳化、凝胶和稳定能力[17]，这与赛里木酸奶的拉丝特性相关。此外，在发酵过程中，链球菌与乳杆菌的协同作用能更快地形成更多的乳酸和芳香化合物[12]。

高冬腊对赛里木酸奶进行高通量测序，发现乳杆菌属为优势菌属，其次为链球菌属[1]。本研究中链球菌属为优势菌属，其次为乳杆菌属，链球菌属为唾液链球菌嗜热亚种，乳杆菌属主要包含希尔加德氏乳杆菌和鼠乳杆菌(Lactobacillusminurnius)。不同样本的的细菌群落组成有所差别，但链球菌属和乳杆菌属在赛里木酸奶中占比均最高。此外，吴阳[5]、玛依诺·木图拉等[4]，利用传统的纯培养方法从赛里木酸奶中分离得瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)；吐汗姑丽·托乎提[18]从赛里木酸奶分离得德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜热链球菌和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

雷华威[2]利用分离自赛里木酸奶的瑞士乳杆菌单独或与嗜热链球菌、马斯克鲁维酵母混合发酵酸奶，单独发酵时包含8种挥发性成分，其中脂肪酸为主要风味物质；与嗜热链球菌共发酵时产生10种挥发性成分，乙偶姻为主要风味物质；三者共发酵时检测到11种挥发性成分，乙醇、乙酸乙酯和3-羟基-2-丁酮是主体风味物质，随着菌种种类的增加酸奶的挥发性风味物质种类也随之增加。本研究利用完整土著菌群的赛里木酸奶引子进行发酵，挥发性风味物质组成更加丰富，共有31种挥发性成分，主体风味物质包括酸、酮、酯、醇等物质，酸类物质占比最高，为47.57%，与赛里木酸奶口感偏酸相符。

赛里木酸奶中的主体挥发成分包括乙偶姻、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯。酸类物质促进赛里木酸奶特有感官风味的形成。低分子量脂肪酸一般由微生物作用于脂肪分解产生，赋予酸奶酸爽的口感[19]。乙酸具有醋酸味，正丁酸天然存在于香茅中，普氏栖粪杆菌被认为是最丰富的丁酸产生菌之一，丁酸盐在结肠黏膜中具有抗炎作用[20]。3-甲基戊酸微带清香气息，具有酸的药草气味。正己酸、正庚酸、壬酸都具有脂肪样气味，正己酸还赋予酸奶乳酸味及乳酪味[21]，壬酸还具有椰子香气。辛酸游离于西藏柏木、柳杉、烟草、肉豆蔻等植物精油中，具有微弱水果酸味。酮类物质多由不饱和脂肪酸的氧化或微生物代谢产生，使酸奶具有特征的风味[22-23]。甲基乙酰甲醇(3-羟基-2-丁酮/乙偶姻)具有强烈的奶油香气，是嗜热链球菌发酵糖类产生的特征风味化合物之一[24]。2-庚酮有类似梨的水果香味，2-壬酮呈水果、花、油脂和药草似的香气，2-十一酮浓度低时具有类似桃子的香气，有类似芸香、油脂气息，赋予酸奶奶油、乳酪风味。醇类化合物比较柔和，使酸乳口感更加爽口，是赛里木酸奶中特有风味物质[4]。(+)-5-甲基-2-己醇具有水果的香气，2-乙基-1-己醇有甜味和淡淡的花香，不饱和醇的风味阈值较低，对风味有较大贡献[13]。酯类化合物大多数具有花香和果香，有助于中和发酵乳中脂肪酸尖锐的刺激性气味。乙酸异丙酯、乙酸正丁酯具有水果香，己酸甲酯赋予酸奶令人愉快的气味，5-羟基癸酸-δ-内酯有奶油香味、椰子及桃子的果香气，对酸奶风味起重要作用，增添酸奶的奶香气味[24]。