沉水植物化感抑藻效应及作用模式研究进展

2022-10-04朱丽萍孙丹焱林晓虎黄菊文李光明徐竟成

应用化工 2022年8期

朱丽萍,孙丹焱,林晓虎,黄菊文,2,李光明,2,徐竟成,2

(1.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092；2.长江水环境教育部重点实验室，上海 200092)

当前我国湖泊及城市缓流河道富营养化仍十分严重，藻类频繁爆发导致水体光补偿层变浅、透明度降低、活性藻毒素含量增加[1]，对生态环境和饮用水安全造成威胁[2]。作为重要的初级生产者，沉水植物在抑制藻类生长和修复水体生态方面均具有广阔的应用价值[3]，其生理结构独特，根、茎、叶均可有效吸收营养物质[4]，且能够通过化感作用影响邻近藻类生长，保持自身生存优势。

化感作用是植物(及微生物)产生的次生代谢产物影响生物系统中物种生长和发展的过程[5]，本文主要指与周围生物进行信息传递与相互作用、调节不利因素胁迫的机制。早在1949年，Hasler等[6]便发现，有眼子菜生长的浅水湖泊里藻类数量明显较低，并首次提出水生植物具有特殊抑藻作用。随着水污染加剧、水体富营养化情势严峻，在寻找持久、低毒的生物治理藻类生态控制方法的过程中，揭示大型水生植物化感抑藻原理的研究逐渐引起科研人员的重视。

当前对沉水植物化感作用的研究已取得一定进展，但还缺乏对不同样本化感物质检测结果的差异性比较及对化感物质特殊作用模式的系统总结，而此二者对于沉水植物水生态修复、保育的实践具有重要意义。因此，本文尝试从化感物质成分分析与抑藻机理入手，详细介绍化感物质五种特殊作用模式，以期为未来研究及工程实践中优化沉水植物的类型、数量及应用策略提供一定借鉴意义。

1 沉水植物主要化感抑藻物质

化感物质作为化感作用重要的物质基础，其分离实验始于上世纪80年代。随着分离与检测技术的快速发展，目前已确定了诸多具体的化感物质成分，大多是分子量较小、结构简单的次生代谢产物(酚类、萜类、有机酸、生物碱等)，部分研究结果见表1。

表1 部分常见沉水植物化感物质Table 1 Allelochemicals of some common submerged macrophytes

同时，沉水植物化感物质通常从植物本体、植物种植水、沉水植物与藻类共同培养体系(下文简称草藻共培养体系)水样三种样本中提取，具体成分的检测结果随样本种类、实验条件等的变化而有所不同。

1.1 沉水植物本体化感物质成分分析

Gross等[16]采用水、甲醇、丙酮几种溶剂及其混合物分别进行了沉水植物化感物质提取，结果发现具有中度亲脂性的溶剂(如50%v/v丙酮或70%v/v甲醇)提取到的物质抑藻效应最好，证明了化感物质多具有中度亲油性和一定的水溶性。Xian等[17]在研究金鱼藻对铜绿微囊藻的化感作用时，将清洗后的新鲜植物直接提取挥发物或进行风干研磨，而后均采用0.05%的DMSO溶剂(二甲基亚砜，已被证明此浓度下不会对藻类生长造成影响)提取其中的高脂肪族化合物，检测得出其主要成分为脂类化合物、萜类化合物、酚类化合物和邻苯二甲酸酯类化合物。

面向植物本体进行化感物质提取、分离、检测是最直接、最基础的方式，可以最大限度排除其他外界物质的干扰，但鉴定出的具有抑藻活性的物质经植物产生后是否被释放到水环境中、释放量的多少，以及在实际抑藻中发挥作用的大小都较难明确。

1.2 沉水植物种植水化感物质成分分析

基于上述问题，有研究人员认为水环境作为化感物质转运和作用的媒介，从沉水植物种植水或水浸提液中提取化感物质进行分析可能更加科学。例如有研究对比了金鱼藻本身与种植水中的化感物质，发现前者含有较强的酚酸类抑藻物质，在后者中则没有检出[18]。但水体中化感物质浓度很低，往往需要多种技术联用才能够从其复杂的有机和无机化合物基质中进行化感物质的识别、富集、分离和鉴定，如黄新颖等[19]先后通过过滤、固相萃取、乙酸乙酯液相萃取、旋转蒸发和氮气流吹脱等步骤，才利用GC-MS技术检测得出以醇、脂肪酸、酚酸、羟基酸为主的21种化感物质，必要时甚至需要人工合成某些典型物质以进一步进行结构验证和生物测试[18]。

然而种植水化感物质成分分析也存在一定的问题，如实际水体环境藻类胁迫作用下，沉水植物释放的化感物质种类及含量是否有变化仍需进一步探究。

1.3 草藻共培养体系化感物质成分分析

虽然与种植水中化感物质成分分析的方法基本一致，但由于存在沉水植物与藻类在光、营养等方面的竞争作用，草藻共培养体系本身不能直接证明由化感作用引发抑藻效果[16]，且无法证明水中物质来源是植物还是藻类。许多研究优化条件设计试图消除光照、营养等干扰因素的胁迫，如控制光照和连续补充营养元素以保持系统中的氮磷恒定，然而这往往会降低植物化感物质的分泌和释放，导致实验结果偏离实际情况。徐洁等[20]通过固相萃取、甲醇洗脱以及高效液相色谱分析得出，金鱼藻在有无铜绿微囊藻共同培养的实验中释放的化感物质组成不同，藻类胁迫会导致检测结果强极性物质含量下降、弱极性物质含量增加。而藻类与植物释放物质的区分显然需要补充各自单独培养条件下的水中成分检测并进行对比分析才能得出。

2 沉水植物化感抑藻机理分析

沉水植物化感物质进入环境的方式主要包括根系渗出和挥发、淋洗等[21]，其化感活性取决于植物产生量和释放频次[22]、自身特定的毒理学机制[23]以及目标藻类的敏感性[24]，具有作用快、选择性强、有效作用浓度低等优点[18]。目前研究得出沉水植物化感物质抑藻作用机理示意(以蓝藻细胞为例)见图1，主要包括抑制浮游藻类光合作用、造成浮游藻类氧化损伤、影响浮游藻类及其他生理生化过程等。

图1 沉水植物化感抑藻物质主要作用部位及影响(以蓝藻细胞为例)Fig.1 The main action sites and effects of submerged plant allelopathic algae inhibitors (taking cyanobacteria cells as an example)说明：非化感物质主要抑制位点的部分细微结构未在图中绘制和标注

2.1 抑制浮游藻类光合作用

光合作用是植物重要的代谢活动，也是生态系统赖以生存的基础。降低光合效率可以有效抑制藻类生物量增加，是化感抑藻主要机理之一。首先，化感物质会影响对环境波动较为敏感的光系统 Ⅱ(PSII)。朱俊英等[21]在进行草藻共培养实验时分析了铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)叶绿素含量，以及有效量子效率(YII)、最大光能转化效率(Fv/Fm)等叶绿素荧光参数，结果表明处理组铜绿微囊藻光合能力明显下降，PSII为作用位点之一。其次，陈国元等[25]发现铜绿微囊藻叶绿素a含量显著降低的时间明显早于生物量急降的时间，表明化感物质会抑制光合色素合成或对其造成破坏。Zhu等[13]也通过脉冲幅度调制荧光仪证明了化感物质对藻类光合系统活性及电子传递链具有显著抑制作用。

2.2 造成浮游藻类氧化损伤

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)能使藻细胞内活性氧(ROS)的产生与消除处于动态平衡，是重要的保护酶[21]。当藻类受到胁迫时，ROS会因为超过歧化能力而累积并抑制SOD和POD的活性。张庭廷等实验中用酚酸类化感物质处理水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae)以及蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)后发现，细胞SOD活性先上升后下降，且下降速度与细胞受损情况呈正相关；膜脂过氧化分解产物丙二醛(MDA)在实验初期升高、后期逐渐下降，推测化感物质导致藻细胞膜结构解体后死亡[26]。鲁志营[27]也发现焦性没食子酸能够显著诱导铜绿微囊藻的胞内ROS累积并造成DNA断链，同时ROS水平升高会导致半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(即Caspase-3(like)酶)激活，触发铜绿微囊藻细胞程序性死亡。

2.3 影响浮游藻类其他生理生化过程

除以上两种主要作用途径外，化感物质也会对藻细胞微观结构、氮磷代谢和呼吸作用等其他生理生化过程产生影响。Wang等[28]采用流式细胞仪和荧光探针PI分析得出，高浓度化感物质会显著损伤细胞膜完整性并改变细胞内部粒度。化感物质处理前期也会导致铜绿微囊藻呼吸速率明显升高[29]，为蓝藻适应胁迫提供更多能量。邓平[30]发现小茨藻(Najasminor)可明显抑制斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)硝酸还原酶活性，增加其碱性磷酸酶活性，从而影响氮磷代谢。马浩天等[31]实验处理后的藻类可溶性蛋白含量下降，可溶性糖含量则明显增加，认为化感作用可能破坏了藻细胞蛋白合成机制并产生了用于增强抗氧化功能的糖类。刘辉[32]实验结果表明，金鱼藻处理组中铜绿微囊藻藻蓝蛋白相关基因、细胞分裂蛋白、ATP酶表达量等均有下降，而与生命节律相关的基因、部分氧化还原酶基因表达上升。

3 沉水植物抑藻的特殊作用模式分析

3.1 毒物兴奋效应

较多研究表明，沉水植物化感物质对藻类并非是完全的抑制作用，而是表现出“低浓度促进、高浓度抑制”的毒物兴奋(Hormesis)效应。相较于鲜有关注的促进情况，抑制类实验作为达到抑藻生态目的的重点研究更多，即超过某一毒性阈值后，随着化感物质浓度的增加，对藻类的抑制作用也逐渐增强。刘碧云[33]实验中，含2.5,4.5,6.5,8.5 mg/L的焦性没食子酸培养液中铜绿微囊藻Fv/Fm值分别为对照的93.9%,83.7%,66.3%和28.3%。鲁志营[27]也发现铜绿微囊藻DNA断链情况随暴露环境中焦性没食子酸浓度的升高而显著增加。

鲜啟鸣等[34]认为出现毒物兴奋效应是由于化感物质作为植物的次生代谢产物，在低浓度时会被降解成易于为藻类所利用的物质，故达到一定浓度后才能发挥抑制作用。张庭廷等[26]则发现酚酸类化感物质在低浓度时影响了细胞膜通透性，使藻细胞易于吸收营养物质，高浓度时导致细胞膜受损和细胞肿胀、破裂，从而抑制藻细胞生长。具体严谨的毒理学分析还有待深入。

3.2 持续作用

研究发现，如果将植物与藻类分别培养，通过向藻类培养液中外加植物种植水进行抑藻实验，穗状狐尾藻密度需达到65 g/L才能有效抑制铜绿微囊藻生长，且少量多次添加效果要好于大量单次添加。而草藻共培养系统中，穗状狐尾藻仅需1 g/L便可显著抑藻[35]。由此分析，长期持续暴露下，沉水植物释放的低浓度化感物质的抑藻效果能得到显著加强。

Nakai等[12]检测了穗花狐尾藻8种化感物质的每日释放量，发现这些物质在水体中的浓度能够长期保持在一定范围内甚至有所增加，直接证明了化感物质的释放是一个动态持续过程。孙雪梅等[36]则以焦性没食子酸为对象，比较了低剂量多次暴露(0.25 mg/L×4次×5 d，间隔4 h)与单次暴露(5 mg/L) 下铜绿微囊藻的细胞密度、ROS水平及膜系统损伤情况，发现当前者累积暴露量仅为设计暴露量一半时就已超过单次暴露的抑藻水平，验证了前述推断。

因此条件允许的情况下，在实际水体中恢复沉水植物群落，充分发挥化感物质产生和释放的持续作用能使抑藻实践取得更好的效果。

3.3 联合作用

实验系统中藻类与多种植物或多种化感物质共存时，受抑制情况比单独培养某种植物或单独投加某种化感物质更强。同时，实验室生物急性毒性测试显示单种纯化感物质有效抑藻剂量的EC50值约在0.65 ～ 5.5 mg/L之间[13]，而高云霓等[37]测得沉水植物释放到水环境中的化感物质浓度仅能达到μg/L的水平。通过上述研究都可间接推断化感物质相互之间应该存在联合作用，主要表现为加和或协同，即两种或两种以上物质对生物体产生的影响等于或大于其单独作用效果[38]。

化学结构相似的同类化感物质之间联合作用已被证实。Zhu等[13]将4种已知的多酚类化感物质制备了不同组成和比例的混合物，利用TI模型分析它们对铜绿微囊藻的综合影响，模型数值计算大于、等于和小于1分别指示拮抗、加和和协同效应，实验结果为0.36～0.49，表现为明显的协同作用。不同类别的化感物质间也存在联合作用，有研究使用壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3种化感物质制备等浓度比例混合物，其联合毒性表现出显著协同作用，具体效果与单种物质抑藻活性及混合比例有关[39]。

综上可得，凭借化感物质不同种类、不同浓度比例的联合作用，沉水植物可在降低单种活性物质作用剂量的同时达到更好的抑藻效果[2]，这一作用对实际应用具有重要的指导意义。

3.4 选择特性

沉水植物化感作用对象具有选择性，往往为特定的某一种或几种目标生物[8,40]。普遍认为浮游藻类对化感物质表现出不同的敏感性，蓝藻受到的抑制最强，其次是硅藻，绿藻受影响较小[41-42]，这对以蓝藻水华为主的富营养化水体较为有利。如姚远等[43]在20 d培养过程中发现，苦草、金鱼藻、狐尾藻处理的实验组与空白组相比，蓝藻比例明显先下降后上升，硅藻相反，绿藻比例相对稳定。这可能是由于蓝藻作为原核生物进化位较为低级[43]，导致化感物质对其光合作用和电子传递活性的抑制更加强烈[13]。Sabine Hilt[42]认为除却细胞壁和细胞膜特性、吸收机制以及目标生理过程(如光合作用)敏感性的差异，藻类附生微生物的膜结构或能源分配也有影响。另有研究认为，藻类对化感物质的敏感性还受到温度[44]、pH等[45]因素的影响，因此选择特性是否可按物种进行评判仍有待验证。

3.5 抗性特性

有研究认为长期共存于同一生境中的浮游藻类可能经由共同进化和自然选择，在个体遗传水平和物种群落水平对沉水植物的化感物质产生抗性[41-42]。Reigosa等[46]认为，化感作用只能发生在不同栖息地的生物之间，如来自不同湖泊、溪流甚至不同地理区域，即同一生态系统内的生物会彼此适应，化感物质很难发挥作用，此类观点使得化感作用的原位重要性受到质疑。

而Maarten等[41]研究了有无伊乐藻的生态系统中浮游植物群落对伊乐藻化感物质耐受性的差别，在对浮游植物来说足够长的培养周期(4～8周)后，两系统中藻类群落对伊乐藻分泌物的敏感性并无明显差异。原因可能是水体中多种沉水植物释放了不同化感物质，且彼此之间存在联合作用，使得藻类抗性进化受阻。类似的野外研究结果同样表明，有害藻类对化感物质的抗性产生并不显著，加之沉水植物兼具的营养物质吸收作用，利用沉水植物进行抑藻仍有较大的应用潜力和研究价值。

4 实践应用启示

近年来，在受污染的浅水湖泊和城市内河等缓流水体的环境修复和水质保育中，沉水植物展现出重要的生态效应，在控制藻华方面也发挥了较大的作用。有野外研究得出，即使营养物质充足，在夏季长达50 d的大规模培养期内，伊乐藻足以化感控制浮游藻类生长，且后者并未进化出对应抗性，植物抑藻长期稳定应用颇具潜力[41]。在基本排除气候、湖泊规模、群落组成和营养物质浓度等条件的干扰下，沉水植物覆盖率在3%～100%之间均显示出不同程度的化感抑藻效应，且随覆盖率的增加化感作用潜在影响增大[42]。

本研究团队已成功将沉水植物应用在浅水湖泊、城市景观水体生态修复和水质维护、污水厂再生水回用的城市河道水生态控制以及藻华预防的研究与工程实践中，并取得了一定的成果。从研究与应用层面而言，沉水植物对反映藻类最大光能转化效率指标Fv/Fm值的控制，以及对藻华的实际抑制都有显著效果[47]。但对其抑藻机理的深入研究和分析表明，以化感作用为切入点，对于不同地区、不同水体、不同水质特征，结合不同沉水植物的化感特征，依据水体实际情况选择和搭配植物类别，构建多样化的植物修复环境，精细高效地发挥沉水植物的抑藻作用，仍有诸多细节值得深入思考与探索。

除此之外，由于水生植物培育具有生长周期长、管理复杂等问题，短时间内重构受污水体水生植物群落、实现其自然更新十分困难。同时植物释放化感物质过程、活性与作用效果受到多种因素不同程度的干扰，如水中氮磷等营养元素[16,48]、光照和微生物降解作用[42]、温度与季节等[1]。针对这些问题，直接添加易于人工合成的化感活性物质进行抑藻也可纳入考虑范围内。例如，向藻华状态下的云南滇池水样添加L-赖氨酸，可以使其蓝藻生物量在2 d内迅速减少69%～83%[49]。显然，直接添加纯净化感物质具有储存、操作、管理优势，适用水体范围更广，限制因素更少，自然条件下生物降解性好[50]，但由于作用有效剂量明显增大，是否会对水体生态安全造成威胁仍有待进一步评估。