白酒酿造过程中酯类物质形成机理探讨

肖冬光

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

酯类物质广泛存在于自然界的花果中，大多呈现出让人愉悦的芬芳香味。在白酒中，酯类物质是放香的主体，其含量和量比关系决定着酒的风格和质量。同时，有些酯类物质还是白酒中含量较高的有益健康成分，如乙酸乙酯可以排除酒中对人体有副作用的物质，加速人体的新陈代谢，降低过度饮酒对人体造成的伤害；乳酸乙酯可以促进乙醇刺激大脑皮层的作用，使人兴奋；己酸乙酯能起到降低肺火，稳定心肺的作用；庚酸乙酯、亚麻酸乙酯、亚油酸乙酯等高级脂肪酸酯在人体内水解后生成脂肪酸，可抑制胆固醇合成，提高脑细胞活性。

白酒中的风味物质包括酸、酯、醇、醛（酮）及其他一些微量组分，在众多的风味物质中，酯类物质所占比例最大，占总风味物质含量的30 %～70 %。目前为止白酒中已发现的酯类物质有700余种，其中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯被称为白酒四大酯，含量占酯类物质总量的90 %以上。四大酯的含量及其量比关系是决定白酒香型和品质的重要因素，如浓香型白酒要求四大酯的含量己酸乙酯＞乙酸乙酯＞乳酸乙酯＞丁酸乙酯；清香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的比例应在1∶0.6～0.8之间；老白干香型白酒的“乳/乙”比要求≥0.8；酱香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的比例大多在30 %～40 %之间，己酸乙酯10 %左右，丁酸乙酯占5 %左右；米香型白酒中含量最高的是乳酸乙酯，其次是乙酸乙酯，其他酯类物质含量在总酯含量的5%以内。

酯类物质是有机酸与醇类在分子间脱水而生成的一类化合物，白酒酿造过程中酯类物质的形成途径主要有三条：一是由白酒酿造过程中相关微生物的代谢反应生成，包括不同微生物之间的相互作用；二是由酒曲中的酯化酶（脂肪酶）催化有机酸与醇类合成相应的酯类物质；三是游离的酸、醇分子通过化学反应合成相应酯类物质，但化学反应在常温条件下反应时间较长，主要体现在白酒发酵后期以及贮存过程中。

1 微生物代谢生成酯类物质

白酒发酵过程中，存在多种代谢产酯的微生物，包括酵母菌、霉菌、细菌等，酵母菌是主要的产酯微生物。白酒中的酯类物质主要分为两类，即乙酸酯和乙基酯，乙酸酯是乙酸与其他醇类发生酯化反应生成的酯，通式是CHCOOR；乙基酯是乙醇和脂肪酸缩合酯化得到的产物，通式为RCOOCH。

1.1 酵母菌酯类物质合成途径

酵母菌酯类物质形成途径见图1。就乙酸酯的合成而言，先由丙酮酸脱羧为乙醛，再氧化为乙酸，并在转酰基酶作用下生成乙酰辅酶A，或由丙酮酸氧化脱羧为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A 在醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，AATase）的作用下与醇合成乙酸酯。在酵母细胞中，醇酰基转移酶在乙酸酯的生物催化合成中发挥了重要的作用。该酶催化醇类和乙酰辅酶A 生成的乙酸酯，是酵母菌合成乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯等乙酸酯类的关键酶。目前报道的酵母菌醇酰基转移酶的基因包括ATF1、ATF2、Lg-ATF1、EHT1、EAT1 和EEB1，催化乙酸酯合成的主要是ATF1、ATF2 和Lg-ATF1。Verstrepen 等过量表达或敲除酿酒酵母中ATF1、ATF2 和Lg-ATF 基因，结果表明，ATF1 和ATF2 对乙酸乙酯合成的影响较大；Lilly 等分别过量表达酿酒酵母中ATF1、ATF2 和EHT1，结果发现，ATF1 对乙酸乙酯合成的影响最大，其次是ATF2，EHT1 主要影响己酸乙酯含量。本研究室通过同源重组技术构建过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1，同时敲除酯水解酶编码基因IAH1，获得了高产乙酸酯的酿酒酵母重组菌株，与亲本菌株相比，重组菌株乙酸乙酯生成量提高到1303.2 mg/L，为亲本的43.4 倍，乙酸异丁酯和乙酸异戊酯生成量分别提高到10.3 mg/L和80.3 mg/L。

图1 酵母菌酯类物质合成途径

对于乙基酯，酵母菌在生物合成相应酯的过程中脂肪酸先与辅酶A 结合形成相应的脂酰辅酶A，乙醇和脂酰辅酶A 在醇酰基转移酶的作用下生成相应的酯类物质。Saerens 等报道了醇酰基转移酶EHT1 和EEB1 是酿酒酵母中链脂肪酸酯合成的关键基因，催化酯酰基辅酶A 和乙醇合成脂肪酸乙酯（乙基酯）。近年来，陆续有EHT1 和EEB1 基因在酿酒酵母菌株中克隆的报道，Lilly 等报道了酿酒酵母EHT1 基因的过量表达使己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯类的产量增长；Saerens 等报道了酿酒酵母发酵过程中外界参数对EHT1 基因表达水平的影响；李锋等对酿酒酵母醇己酰基转移酶基因EHT1 进行过表达，己酸乙酯的产量提高至原菌种的2.21 倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯也分别提高了31.4%和49.1%。

除乙酰辅酶A 外，酵母菌在白酒发酵过程中很少生成其他脂酰辅酶A，所以酵母菌发酵过程合成的主要是乙酸酯，包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯等，且乙酸乙酯占比达90 %以上。酵母醇酰基转移酶途径为白酒酿造中乙酸酯合成的主要途径，产酯能力强的酵母有汉逊酵母、毕赤酵母（东方伊萨酵母）、假丝酵母、球拟酵母、酒香酵母、白地霉等。酿酒酵母具有相同的酯类物质合成途径，但普通酿酒酵母的产酯能力较低，采用现代生物技术强化醇酰基转移酶途径即可获得高产酯能力的酿酒酵母菌株。

1.2 发酵条件对酵母菌酯合成的影响

酵母菌的酒精发酵和产酯与很多因素有关，包括发酵培养基、温度、pH 值、供氧情况等。近年来，许多研究者从酒曲、酒醅及酿造环境中筛选具有自身特征的产酯酵母，将其应用于白酒生产中，对提高白酒中的酯含量和风味品质起到了较好的效果。不同酵母菌发酵特性差别很大，合适的产酯条件也各不相同，邢爽等研究了不同发酵条件对卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、球拟酵母和高产酯酿酒酵母（重组菌）酒精发酵和产酯的影响，主要结论如下：

（1）在酵母菌乙基酯的合成过程中，从丙酮酸至乙酰辅酶A 需要供氧，因此有氧环境利于酵母菌酯的合成，供氧不足对产酯酵母的酒精发酵和产酯影响最大，对酒精发酵影响最大的是克鲁斯假丝酵母，其次是卡特多菲毕赤酵母和球拟酵母，最后是汉逊酵母；对产酯影响最大的是汉逊酵母，其次是卡特多菲毕赤酵母和球拟酵母，最后是克鲁斯假丝酵母；对高产酯酿酒酵母的酒精发酵和产酯影响不明显。

（2）pH 值对卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母的酒精发酵和产酯有一定影响，对酿酒酵母的影响相对较小，卡特多菲毕赤酵母的最适产酒pH5.0，克鲁斯假丝酵母和球拟酵母最适产酒pH4.0，汉逊酵母最适产酒pH6.0～7.0，上述4 种产酯酵母的最适产酯pH 值均为6.7，高产酯酿酒酵母的最适pH6.0～7.0。

（3）温度低于28 ℃时球拟酵母、卡特多菲毕赤酵母、汉逊酵母和克鲁斯假丝酵母发酵酒度下降，对高产酯酿酒酵母无明显影响；温度对各种酵母的产酯有显著影响，卡特多菲毕赤酵母的最适产酯温度为20 ℃，克鲁斯假丝酵母、球拟酵母和高产酯酿酒酵母为24 ℃，汉逊酵母为28 ℃。

众所周知，白酒发酵过程是在厌氧和低pH 环境下进行的，耗氧的汉逊酵母、假丝酵母、毕赤酵母等是白酒生产中常用的产酯酵母，直接入池发酵对大曲酒的增酯效果不一定明显。如果将这些酵母在池外单独培养，在适合酵母产酯条件下制备成酯化液或固态香醅，再入池发酵或与池内酒醅混蒸，可有效提高成品酒中的酯含量。对于小曲白酒、芝麻香型白酒、酱香型白酒，由于其生产工艺中有堆积培菌过程环节，此过程是有氧的，如果在堆积培菌前接入这些产酯酵母与传统糖化发酵剂协同糖化发酵，可明显提高酯含量。高产酯酿酒酵母具有广泛的适应性，其应用方式不受限制，既可池外培养后入池发酵，也可直接入池发酵。此外，大多数产酯酵母的适宜产酯温度都在28 ℃以内，温度高时产酯能力明显下降。

2 酯化酶催化合成酯类物质

2.1 白酒酿造中酯类物质的酯化酶合成途径

酯化酶是催化合成低级脂肪酸酯的酶类的总称，包括脂肪酶、酯合成酶和磷酸酯酶。在白酒酿造中，酵母菌和细菌都有产酯能力，但胞外酯化酶的产生菌主要是霉菌。白酒酿造中使用的各种酒曲都含有一定的酯化酶，其中大曲和麸曲的酯化酶活性较高，小曲的酯化酶活性相对较低。白酒酿造中酯类物质的酯化酶合成途径见图2，在酒曲中酯化酶的作用下，催化白酒发酵前期微生物代谢生成的酸类物质和醇类物质合成相应的酯类物质。醇类物质主要由酵母菌代谢生成，除乙醇外主要有正丙醇、异戊醇、异丁醇、正丁醇、仲丁醇、β-苯乙醇、2,3-丁二醇等；酸类物质主要由各类产酸细菌代谢生成，主要有乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸等；6 个碳原子以上的中、高级脂肪酸主要来源于酿酒原料。

图2 白酒酿造中酯类物质的酯化酶合成途径

大曲中的红曲霉、白地霉、根霉、曲霉和毛霉等微生物均具有酯化能力，不同酒曲培养条件不同，网罗的微生物菌群和形成的酯化酶系组成也不同，催化不同酯的合成效果也不相同。以大曲酯化酶为例，3 种典型大曲催化合成乙酸乙酯的酶活力，清香型大曲＞浓香型大曲＞酱香型大曲；催化合成己酸乙酯的酶活力，浓香型大曲较强，清香型大曲与酱香型大曲酶活力相对较低；催化合成丁酸乙酯的酶活力，清香型大曲＞浓香型大曲＞酱香型大曲；3 种香型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力都较低，清香型和浓香型大曲稍高些。

酯化酶的催化反应为可逆反应，只有在一定条件下表现为合成反应。除底物（酸、醇）浓度外，酸度对大曲酯化酶催化反应影响最大，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯合成的最适pH 值为4.0～4.5，乳酸乙酯则为pH6.0～7.0，当pH≤2.0～3.0 时酯化酶催化酯类物质的分解。酸是酯类物质合成的底物之一，但酸度过高不仅严重影响出酒率，而且酸酒的酯类物质含量反而低，即发生“掉排”现象。在温度高、湿度大的夏季，酿酒车间环境中的产酸微生物密度大、繁殖速度快，白酒生产时容易造成酒醅酸度过高，白酒质量下降，甚至发生“掉排”现象。这也是大多数白酒厂选择在夏季停产检修的原因之一。

在白酒酿造中，酯化酶合成途径是己酸乙酯和丁酸乙酯合成的主要途径，即由窖泥菌群生成的己酸和丁酸和由酵母菌群生成的乙醇在大曲酯化酶的催化作用下生成己酸乙酯和丁酸乙酯。对于乳酸乙酯，由于酿造环境的酸度较高，而大曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的适宜pH 值接近中性，因此乳酸乙酯很难通过大曲酯化酶催化合成。此外，由于醋酸菌是耗氧微生物，乙酸的生成依赖于乙醇和氧，当酒醅中的乙醇达一定浓度时氧已被酵母菌等耗尽，由此可见乙酸乙酯合成的主要途径也不可能是胞外酯化酶途径，而是前述的酵母菌合成途径。对于有培菌过程的白酒生产（如米香型酒、小曲清香型酒、酱香型酒、芝麻香型酒等），培菌糖化过程的有氧环境较易网罗醋酸菌，酯化酶合成途径也可能成为乙酸乙酯合成的主要途径之一。

2.2 酯化酶在白酒生产中的应用

酯化酶不同于酶学上的脂肪酶，脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶，既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油，又能催化脂肪的合成，即脂肪酶是指水解三羧酸甘油酯的酶；酯化酶则是泛指可以催化有机酸和醇类物质合成酯的酶，也是水解羧酯键的酶。酵母、霉菌、细菌中均含有酯化酶，细菌脂肪酶大多为中性或碱性脂肪酶，在白酒酸性环境下不具活性或活性很低；在白酒酸性环境下能够催化合成酯类物质的主要有南极假丝酵母、紫红曲霉、烟色红曲霉、华根霉、米根霉等微生物所产的酯酶。

酯化酶在白酒生产中的应用始于20 世纪90 年代，1993 年，庄名扬等从全兴酒厂大曲中分离出一株高产酯化酶的曲霉菌9055，将该菌的粗制酯化酶（麸曲酯化酶）应用于缩短全兴大曲酒的发酵期生产试验，结果表明，发酵期40 d 的10 批次白酒样中的己酸乙酯含量高于发酵期60 d 的对照样。此后，多种霉菌的粗制酯化酶成为白酒厂提高成品酒质量的主要措施之一，如武建国等在酒醅中加入红曲酯化酶发酵后，己酸乙酯含量增加了124.8～162.5 mg/100 mL；杜礼泉等对烟灰色红曲霉酯酶的酯化特性进行了研究，该红曲霉酯酶对乙酸、丁酸、己酸都有较强的酯化作用，应用在浓香型大曲酒生产中能同时提高四大酯的含量；崔如生等用R92 华根霉酯化生产高己酸乙酯调味酒，用于新型白酒的生产，减少了白酒香料的用量，提高了新型白酒的质量；王述荣等研制的粗酶制剂YH-AM用于洋河大曲酒的生产，出酒率提高7.2%，优质酒率提高19.6%；信春晖等在扳倒井大曲酒生产中添加复合酯化酶，平均出酒率提高6.7%，优质酒率提高7.3 %；贾超英等在泰山特曲生产中添加复合酯化酶，优质酒率提高6.1%；樊琪在阁老贡酒生产中添加3 株菌种的复合酯化酶，出酒率提高5.0%，优质酒率提高到41.2%。

有关霉菌酯化酶的应用大多集中于浓香型白酒，主要是霉菌酯化酶催化己酸乙酯合成的效果相对较好。许春艳等发现紫色红曲霉YJX-8 酯化酶对己酸的酯化较对丁酸、乙酸的酯化作用更强；唐玉明等在对红曲酯化菌21-3 的特性研究中发现，四大酸和乙醇各自反应都可生成相应的乙酯，但是四大酸的混合物生成的酯主要是己酸乙酯；任道群等对红曲霉和根霉菌进行了混合酸（乙酸、己酸、乳酸、丁酸等比混合）酯化效果的比较，结果表明红曲霉生成的酯类物质均为己酸乙酯，根霉菌能生成少量的己酸乙酯和乳酸乙酯。

大量报道表明，脂肪酶在有机相中对酯类物质的合成转化率比较高，卢世珩等报道根霉菌所产脂肪酶在有机相体系下己酸乙酯的酯化率可达到91%；刘光烨等利用烟色红曲霉所产脂肪酶考察了不同体系下酯化己酸乙酯的效率，在环己烷体系中的酯化率高达98%。白酒实际生产属于水相体系，酯化过程的产物之一是水，酯化反应是可逆反应，因此在水相中酯的合成转化率相对较低。王丹丹等对固定化南极假丝酵母脂肪酶B(Novozym 435)催化白酒四大酯的合成与分解进行了研究，结果表明，4 种酯在水相中有利于分解，分解转化率为乙酸乙酯＞丁酸乙酯＞乳酸乙酯＞己酸乙酯；在有机相(正己烷)中有利于合成，合成转化率为己酸乙酯＞丁酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯；在水相中酯化反应5 h 的最高合成转化率分别为乙酸乙酯8.9 %、丁酸乙酯29.1 %、己酸乙酯16.7 %、乳酸乙酯5.7 %，大大低于水相中的水解转化率和有机相中的合成转化率。脂肪酶在水相体系中酯化合成的低效率限制了商品化脂肪酶在白酒生产中的推广应用，因此，目前白酒生产中使用的酯化酶主要是以麸皮为主要原料生产的粗酶制剂（麸曲）。

3 化学反应合成酯类物质

白酒酿造过程是一个复杂而漫长的过程，在这一过程中会产生众多化学物质，不乏大量的酸类化合物和醇类化合物。除了酿造过程中微生物代谢作用产生大量的酸类化合物和醇类化合物外，在原料中也存在大量酸类和醇类化合物。这些化合物除了通过产酯微生物代谢或酯化酶催化途径合成酯类物质外，还有一部分可通过单纯的有机化学反应生成，主要有乳酸乙酯和大多数高级脂肪酸酯。

化学反应酯的合成量主要取决于相应的底物（醇和酸）浓度、酸度和发酵（反应）周期，H是酯化反应的催化剂，当白酒发酵时的酒醅酸度较高时，有机酸和醇类物质通过化学反应合成相应酯类物质的比例就较多。由于有机酸和乙醇的化学反应合成酯类物质需要较高酸和乙醇，因而化学合成酯类物质主要发生在发酵中、后期，需要较长的发酵周期才能积累较多的酯。在白酒发酵酒醅或醪液中，乳酸是含量最高的有机酸，一般为15～40 g/kg酒醅，通过化学反应合成的乳酸乙酯也是各酯类物质中最多的，延长发酵周期往往可积累较高的乳酸乙酯，增加白酒的醇厚感。邢爽研究了清香、浓香、酱香3 种典型大曲催化合成乳酸乙酯的酶活力，结果表明，大曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最适pH 值均为6.0～7.0，在pH≤4.0 时催化效率很低或为负值（分解乳酸乙酯），说明在白酒酿造的酸性环境下乳酸乙酯很难通过大曲酯化酶途径合成。

在白酒蒸馏和贮存老熟过程中也同样存在酸-醇酯化反应。白酒蒸馏时温度较高，酒醅中含量较高的有机酸与乙醇反应合成相应的酯类物质。乳酸是酒醅中含量最高的有机酸，部分乳酸与乙醇反应合成乳酸乙酯，但乳酸乙酯的亲水性较强，仅有30%左右蒸馏至基酒中，大部分乳酸乙酯残留在糟醅中。酯化反应是可逆反应，白酒在贮存过程中，除少数酒样中的乙酸乙酯增加，几乎所有的酯都有所减少，与此相对应的是酸增加，尤其是乙酸、丁酸、己酸、乳酸。这是因为白酒蒸馏时，酒醅中的酯较易挥发，相应的酸挥发性差，部分或大部分留在糟醅中，在白酒贮存过程中酸、醇、酯的反应平衡趋向于酯类的水解。对于高度白酒，由于反应底物之一的乙醇含量较高，部分抵消了酯的分解作用；对于低度白酒，由于乙醇含量不高，贮存过程中酯类物质的分解作用较为明显。

4 结论

（1）在白酒发酵过程中酯类物质的形成包括微生物代谢生成、酯化酶催化合成和化学合成三部分。不同酯类物质形成的机理和途径有所不同，乙酸酯类主要由酵母菌在发酵前期代谢生成，发酵后期随着酵母活力的下降和酒醅酸度的升高，乙酸乙酯大多呈缓慢下降趋势；己酸乙酯、丁酸乙酯主要由窖泥菌群产生己酸和丁酸与酒醅中酵母菌群产生的乙醇，在大曲酯化酶催化作用下合成，由于己酸和丁酸需由窖泥通过分子扩散至酒醅中才能在酯化酶作用下合成酯，因此离窖泥较远的酒醅中己酸乙酯和丁酸乙酯的含量往往很低，采用己酸菌液灌窖的办法可有效提高窖池中央酒醅的己酸乙酯含量；乳酸乙酯主要由酒醅中乳酸菌群产生的乳酸与酵母菌群产生的乙醇通过化学反应合成，由于化学反应的速度缓慢，所以乳酸乙酯的积累需要较长的发酵周期。

（2）酯化酶催化反应为可逆反应，只有在一定条件下表现为合成反应，酸度对酯化酶催化反应影响最大。不同酯化酶酯合成的适宜酸度不同，同一酯化酶催化不同酯合成的最适酸度也不相同，在酸度达一定程度时酯化酶催化酯的分解。在白酒发酵过程中，酵母菌群生长代谢旺盛、酒度过高会抑制产酸菌群的生长与代谢，导致酒醅酸度低、酯香物质含量低，白酒质量下降；产酸菌群生长代谢旺盛、酸度过高又会抑制酒精发酵，不仅出酒率很低，酯含量也不会高（因为底物之一的乙醇含量不高，且酵母菌活力低），发生酸败。由此可见，在白酒生产中控制合适的微生物菌落结构和酒醅酸度特别重要。

（3）白酒发酵过程是在厌氧和高酸度环境下进行的，耗氧的汉逊酵母、假丝酵母、毕赤酵母等产酯酵母，直接入窖发酵对白酒的增酯提质效果不一定明显。如果将这些酵母在窖外单独培养，在适合酵母菌产酯条件下制备成酯化液或固态香醅，再入窖发酵，可有效提高成品酒中的酯含量。对于米香型白酒、小曲清香白酒、芝麻香型白酒、酱香型白酒等，生产工艺中有堆积培菌过程环节，如在堆积培菌前接入产酯酵母与传统糖化发酵剂协同糖化发酵，可明显提高酯含量。对酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、东方伊萨酵母等兼性厌氧酵母菌，在有氧和厌氧环境下都能生长代谢，选育具有高产酯能力的酵母即可直接入窖发酵提高白酒酯含量。

（4）白酒发酵过程中上述3 种途径酯的合成与分解交织在一起，相互补充且相互制约，不同的发酵条件改变酯的合成方向与风味物质的量比关系，从而形成了不同风格的白酒，机理相当复杂。深入了解白酒发酵过程中酯类物质代谢与合成的机制，明确白酒生产企业实际发酵过程中酯类物质的形成规律，对指导白酒生产、提高白酒酯类物质的含量、调控风味物质合适的量比关系、改善白酒品质、促进我国白酒产业的技术升级具有重要意义。