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Id1、β–catenin、cyclin D1 在结直肠腺瘤和结直肠癌中的表达意义

2022-10-04陈玉北王觅柱

中国现代医生 2022年24期
关键词:组织化学印迹细胞周期

陈玉北 王觅柱

1.包头医学院研究生学院,内蒙古包头 014040;2.包头医学院第二附属医院消化内科,内蒙古包头 014031

结直肠癌是较常见的恶性肿瘤,近年来发生率及病死率呈上升趋势,分别居于第3 位和第5位。在亚太地区,我国结直肠癌的发生率处于首位,发病年龄逐渐年轻化,且有研究发现其发生率城市高于农村。该疾病严重威胁我国民众的健康,有研究表明大部分的结直肠癌病例由结直肠腺瘤恶变引发,结直肠腺瘤已是公认的癌前病变。结直肠腺瘤恶变的机制极其复杂,研究其分子机制具有重大意义。分化抑制因子1(differentiation inhibition factor 1,Id1)可抑制下游基因表达,起到抑制细胞分裂的作用,β–联蛋白(β–catenin)是Wnt 通路的重要组成部分,在多种肿瘤中均存在Wnt 通路上调的情况。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)可调控细胞周期,其高表达可引发细胞周期失控,导致肿瘤发生、发展。本研究通过检测结直肠癌组织、癌旁组织、结直肠腺瘤中的Id1、β–catenin、cyclin D1 表达情况,分析其临床意义并探讨其可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2021 年5 月至2021 年10 月包头医学院第二附属医院消化内镜中心结直肠镜下取病理的结直肠癌癌旁组织、结直肠腺瘤组织、结直肠癌组织各30 例,用于蛋白质印迹法实验。同时收集相应组织的存档蜡块,用于免疫组织化学实验。本研究全部病例均经过病理确诊,临床资料完整。纳入标准:术前未进行任何抗肿瘤治疗,未进行放疗和化疗;癌旁组织距离肿瘤>5cm。排除标准:术前经过放疗、化疗等抗肿瘤治疗;癌旁组织距肿瘤<5cm。

1.2 主要试剂

兔抗人Id1 多克隆抗体IgG(英国Abcam 公司,稀释度为1∶50);兔抗人β–catenin 单克隆抗体IgG(美国Proteintech 公司,稀释度为1∶700);兔抗人cyclinD1 单克隆抗体IgG(美国Proteintech 公司,稀释度为1∶100);酶标山羊抗兔IgG 聚合物(武汉爱博泰克生物科技有限公司);DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);BCA 试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 蛋白质印迹法

待测组织研磨后加入0.4ml 蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液,12000 转/min 离心10min,蛋白质印迹法测上清液蛋白浓度,加样到SDS–PAGE 中电泳,浓缩胶和分离胶电压分别为80V、120V,时间分别为30min、70min。恒流400mA,转膜2h,奶粉封闭后孵育一抗过夜,孵育二抗后显影和曝片,Bio–rad 扫描条带,ImageJ 测灰度值,所测灰度值进行归一化处理(除以内参灰度),最终获得相对蛋白表达量。内参蛋白选取β–actin。

1.4 免疫组织化学法

蜡块切片固定于载玻片,烤片后脱蜡,水化后修复,加入过氧化物酶阻断剂,孵育10min,加入一抗过夜,加入二抗孵育20min,加入DAB 显色液,显色后马上放入蒸馏水,复染、反蓝、脱水后封片,显微镜下观察。主要观察指标为染色强度及阳性率,强度评分:阴性为0 分、弱阳性为1 分、中阳性为2分、强阳性为3 分。阳性率评分:0 分,阴性;1 分,阳性率1%~33%;2 分,阳性率34%~66%;3 分,阳性率67%~100%。免疫组织化学评分由以上两部分评分相加得出。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组织化学结果

Id1 主要表达于细胞质,β–catenin 主要表达于细胞核和细胞质,cyclin D1 主要表达于细胞核,阳性表达呈现棕黄色染色,见图1。腺瘤组织中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫组织化学评分均显著高于癌旁组织,差异均有统计学意义(<0.05),结直肠癌组织中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫组织化学评分均显著高于腺瘤组织,差异均有统计学意义(<0.05),见图2。Spearman 相关分析结果显示,Id1 与β–catenin表达呈正相关(=0.399,<0.01),β–catenin 与cyclin D1 表达呈正相关(=0.440,<0.01)。

图1 Id1、β-catenin、cyclinD1 免疫组织化学染色情况(×200)

图2 3 种组织免疫组织化学评分比较

2.2 蛋白质印迹法结果

蛋白质印迹法结果表明Id1、β–catenin、cyclin D1在癌旁组织、结直肠腺瘤、结直肠癌组织中均有表达,见图3。腺瘤组织中的Id1、β–catenin、cyclin D1表达均显著高于癌旁组织,差异均有统计学意义(<0.05),结直肠癌组织中的Id1、β–catenin、cyclinD1 表达均显著高于腺瘤组织,差异均有统计学意义(<0.05),见图4。Pearson 相关分析发现Id1与β–catenin 表达呈正相关(=0.306,<0.05);β–catenin与cyclin D1 表达呈正相关(=0.367,<0.01)。

图3 Id1、β-catenin、cyclin D1 的蛋白质印迹法结果

图4 3 种组织中的Id1、β-catenin、cyclin D1 相对表达量比较

3 讨论

近年来,随着生活水平的提高,人们的饮食结构发生改变,高脂肪、高蛋白质类食物摄入过多,结直肠癌患病人数明显上升,2020 年结直肠癌新发病例数位居所有肿瘤的第3 位,死亡病例数位居第2位。研究表明,结直肠癌大多都经历由腺瘤发展到癌的典型病理过程,该过程一般需5~10 年,为早诊断、早治疗提供了时间窗。临床上,腺瘤恶变所引发的结直肠癌在全部病例中占比很高。因此,深入研究结直肠癌的发生发展机制十分重要。

Id1 属于分化抑制因子(differentiation inhibition factor,Id)家族,在多种肿瘤中均表达升高,但仍无研究证明Id 基因突变及异常扩增存在于肿瘤中,因此有学者将Id 称为准原癌基因。研究表明,Id1在结直肠癌组织中高表达,尤其是低分化癌,其表达上调更为明显。设法降低Id1 表达后,发现结直肠癌细胞增生能力减弱、侵袭力下降,抑制Id1 表达,可抑制cyclin D1 表达,调控细胞周期,降低S 期细胞比例,抑制细胞分裂。增加Id1 表达,则可增加结直肠癌组织新生血管密度。因此,Id1 在结直肠癌中起到十分重要的促进作用,但关于Id1 在结直肠腺瘤恶变中的研究仍较少。本研究表明,Id1 在癌旁组织、腺瘤组织、结直肠癌组织中的表达逐渐升高,这也许说明,Id1 在从腺瘤到癌这个典型的过程中发挥重要作用,Id1 有望成为新的肿瘤标志物,用于结直肠腺瘤恶变的早期筛查,同时Id1 也有望成为治疗的新靶点,通过抑制Id1 表达,抑制从腺瘤到癌的病理过程,阻断结直肠癌的发生、发展。

Wnt/β–catenin 通路的上调在多种肿瘤中均有肿瘤促进作用。该通路的激活在结直肠癌中普遍存在,其调节结直肠癌细胞生物学行为的研究也较为广泛,如下调结直肠癌中的该通路,可抑制c–Myc、T 细胞因子– 4 表达,从而抑制结直肠癌细胞的增生能力。该通路的下调也可降低肿瘤的侵袭和转移能力。β–catenin 蛋白是通路中主要的信号分子,对该通路意义重大。Cyclin D1 是该通路下游分子,cyclin D1 激活可导致细胞周期失去原有节律,加快细胞周期进程,促进肿瘤细胞增殖。Cyclin D1已被证实为原癌基因,cyclinD1 在正常组织细胞中呈恒量表达,在诸多肿瘤细胞中呈高表达,与肿瘤关系密切。本研究表明,β–catenin 及cyclin D1 在癌旁组织、结直肠腺瘤、结直肠癌中的表达呈逐渐上升趋势,提示在从结直肠腺瘤到结直肠癌的过程中,β–catenin 及cyclin D1 起到重要作用,有望成为新的肿瘤标志物,应用于结直肠腺瘤恶变的早期筛查中,同时也有望成为治疗的新靶点,通过抑制其表达,从而阻断结直肠癌的发生、发展。

β–catenin 及cyclin D1 在癌旁组织、结直肠腺瘤、结直肠癌中的表达呈依次上升趋势,相关分析证明,二者的表达呈正相关性,这充分佐证cyclin D1 作为Wnt/β–catenin 通路的下游分子,受到通路的调节。有研究表明,结直肠癌细胞中的Id1 可通过激活PI3k/Akt 通路上调cyclin D1 表达。本研究证明Id1与β–catenin 呈正相关,这也许说明在结直肠腺瘤恶变过程中,Id1 也可能通过激活Wnt/β–catenin 通路进而调控cyclin D1 表达,从而起到促进肿瘤发生、发展的作用。由于结直肠腺瘤恶变过程中的分子生物学机制十分复杂,且本研究仅通过蛋白质印迹法及免疫组织化学法进行,若能进一步通过细胞学实验对该结果进行进一步分析及验证,则能进一步阐释该过程中的分子生物学机制,有望为早发现、早诊断、早治疗结直肠癌提供新的理论依据及分子生物学基础。

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