猪场新生仔猪急性腹泻的病原调查

范学伟 ，王鉴波 ，姜 鑫 ，李晓娟 ，陆子秀 ，李树东

（1.黑龙江农业经济职业学院，黑龙江 牡丹江 157041；2.牡丹江市动物卫生监督所，黑龙江 牡丹江 157041）

近年来在全球暴发的猪场产房新生仔猪顽固性腹泻是困扰养猪业发展的一个大难题，主要感染2～7日龄新生仔猪，感染场产房新生仔猪病死率高达到100%，对发病场造成巨大经济损失。猪场新生仔猪感染的临床表现如下：发病没有季节性，一年四季都有可能发生；哺乳母猪精神状态、采食和排便正常；多数在仔猪吃完初乳后立即发病，每窝仔猪出现腹泻达半数后，母猪就出现回奶现象；腹泻仔猪发病初期排黄色油状稀粪、后变为黄水样稀便、体温下降、最终脱水消瘦而死；一窝中最初只有1～2头发病，后表现为整窝发病，传播速度快；发病急，抗生素和抗病毒药物治疗无效果、死亡率非常高。病死仔猪病理变化：发生腹泻仔猪脑部有出血或渗出液、心肌松弛、肝淤血、胆汁充盈、胃胀积食、膀胱积尿、肠系膜淋巴结肿胀、小肠内有黄色稀便、小肠壁菲薄有大量气体、肾脏变形、肾盂有尿酸盐结晶等多种症状。

文献报道能够引发产房新生仔猪腹泻的病原种类较多，包括细菌、病毒、寄生虫病原体或营养影响因子等。为调查黑龙江省猪场产房新生仔猪腹泻的感染病原，笔者所在团队选择黑龙江省3个生产条件较好的发病猪场，结合新生仔猪临床表现和病理变化，采集母猪血样20份/场，共计60份血样。分离血清进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病野毒的抗体检测，对猪群基础免疫进行评价。挑选20窝产房腹泻严重猪场无菌采集血液、脑组织、肠系膜淋巴结、脾脏、十二指肠、小肠内容物共计20份，对病料分别进行大肠杆菌分离鉴定，等孢球虫检查，猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（RV）、德尔塔病毒（PDCoV）PCR核酸检测。通过临床治疗和病原检测双重分析，确定造成黑龙江地区猪场产房新生仔猪腹泻的主要感染病原，为今后猪场在新生仔猪腹泻防控中提供参考。

1 大肠杆菌分离

1.1 材料与方法

对猪场无菌采取的病死猪的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结等实质性器官作为病原分离材料。无菌条件对深层组织进行划线并接种于麦康凯琼脂平板、普通琼脂平板和血液琼脂平板上，于37℃培养24 h。

1.2 结果

利用3种培养基对埃希氏大肠杆菌分离培养的结果：1）麦康凯培养基上没有红色菌落生长；2）未在普通琼脂培养基上分离到直径约2 mm的圆形、光滑、湿润、隆起、半透明淡灰色的菌落；3）血液琼脂平板上生长的菌落没有出现β溶血现象。在猪场采集的实质性器官病料中未分离到埃希氏大肠杆菌。

1.3 分析与讨论

猪场提供的治疗方案，曾对发生腹泻仔猪进行抗生素+补液同时治疗。按药物说明对腹泻仔猪肌注过喹诺酮类和四环素类药物，按体重口服氨基糖苷类治疗药物，选择的这些药物都是治疗肠道大肠杆菌的敏感药物；为防止仔猪脱水死亡，猪场对腹泻仔猪进行腹腔补液，补液配方为1 000 mL生理盐水中添加葡萄糖20 g，碳酸氢钠2.5 g，氯化钠3.5 g，氯化钾1.5 g，抗生素+补液治疗腹泻仔猪没有治疗效果。结合实验室的细菌分离结果，可以确定3个场仔猪腹泻高死亡率的感染病原并非大肠杆菌。

2 猪等孢球虫检查

2.1 材料与方法

对发病仔猪十二指肠和小肠病料用洁净的玻璃片或小勺刮取肠道粪便和肠管内壁黏液，取4 g肠道刮取物于100 mL洁净烧杯中，先向烧杯中加入10 mL含尿素的猪球虫检测漂浮液，搅拌均匀；再继续向烧杯中加入漂浮液40 mL，再次搅拌均匀。重新准备一个同体积的洁净烧杯，将50 mL的液体刮取物混合液用60目的铜筛过滤到一个同体积的干净烧杯后静置，静置10 min。用取液环取烧杯滤液表面溶液2滴于载玻片同一位置，覆盖玻片，完成一个待检玻片，重复制作3～5个玻片，置于光学显微镜（10×10）下检查猪等孢球虫卵囊，记录检测结果。

2.2 结果

猪等孢属球虫卵囊的形态特征，卵囊内有胚孢子并形成2个孢子囊，每个孢子囊内含4个子孢子。对腹泻仔猪肠道刮取物制备液制成的5份玻片均未检查到有猪等孢球虫卵囊。

2. 3 分析与讨论

患球虫病后发生腹泻的仔猪，多数发病仔猪日龄集中在10～15日龄，3日龄和21日龄腹泻仔猪粪便中也可检测到猪等孢球虫，病程可持续4～8 d。病初排出黄色水样的稀粪，粪便污染仔猪全身，散发出腐败的酸臭味，经过4～5 d粪便转为糊状的淡绿色粪便；发生感染的断奶仔猪感染后约5 d左右出现临床症状，病猪表现出精神沉郁，食欲不振，发生腹泻，排出水样的灰色粪便，粪便中存在少量的肠组织脱落碎屑，发病症状严重的嘴唇周围和腹下皮肤发绀，快速出现脱水死亡。病猪体况较差，表现消瘦、脱水、发育迟缓，抗生素治疗无效或反复，死亡率可达10%～50%。

通过对仔猪等孢球虫感染特点分析，结合刮肠液玻片检查结果，确定送检猪场新生仔猪腹泻的感染病原并非是猪等孢球虫。

3 血清学抗体检测

3.1 材料与方法

猪瘟病毒（CSFV）抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测试剂盒、猪伪狂犬病毒（PRV）抗体（gI）检测试剂盒（购于北京爱德士元亨生物科技有限公司），酶标仪，洗板机，微量移液器。

3个猪场出现腹泻母猪的每个场采血20头，共采样60血样，分离血清进行ELISA抗体检测，所有的试剂盒组分实验前恢复到室温18～25℃。

3.1.1 猪瘟病毒抗体检测

按照试剂盒说明书操作步骤操作，最后用酶标仪450 nm 处测定样本以及阴性和阳性对照的吸光度值，获得被检样品的OD450值（ODTEST）、阳性对照的平均值（ODPOS）、阴性对照的平均值（ODNEG）。根据阻断率=（ODNEG-ODTEST）/ODNEG× 100%公式计算被检样本阻断率，被检样本的阻断率大于或等于40%，该样本就可以被判为阳性（有CSFV抗体存在），如果被检样本的阻断率小于或等于30%，该样本就可以被判为阴性（无抗CSFV抗体存在）。

3.1.2 猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）病毒抗体检测

按照试剂盒说明书操作步骤操作，最后用酶标仪650 nm 处测定样本以及阴性和阳性对照的吸光度值，获得被检样品的OD值样本A（650）、阳性对照的平均值（OD PCx）、阴性对照的平均值（OD NCx）。根 据S/P=（A650-NCx）/（OD PCx-OD NCx）公式计算每个样品S/P值。猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的有无（阳性/阴性）通过计算每个样品的S/P值判定；如果S/P值低于0.4，样品应判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性；如果S/P值大于或等于0.4，样品应判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性。

3.1.3 猪伪狂犬病毒（PRV）抗体（gI）检测

按照试剂盒说明书操作步骤操作，测量并且记录被检样品和对照的A(650)，阴性对照平均值（NC），根据S/N=样本A（650）/NC公式计算样品的S/N值,S/N值低于或等于0.60，样品应判定为PRV gI抗体阳性。S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gI抗体阴性。

3.2 结果

3个猪场母猪猪瘟抗体阻断率平均值分别为73%、78%、83%，阳性率100%，离散度分别为17%、15%、22%；猪伪狂犬病野毒抗体阳性率全部为0%；猪蓝耳病病毒抗体S/P值 平均 值1.3、1.6、1.8，阳性率100%，离散度分别为18%、26%、32%。

3.3 分析与讨论

通过对检测的3个猪场60份血清进行猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征血清学抗体检测结果阳性率和平均值分析，猪场处于免疫合格水平，离散度均小于50%，说明猪场猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征整体免疫较好，对产房新生仔猪腹泻没有影响。

4 荧光定量PCR核酸检测

4.1 材料与方法

猪流行性腹泻病毒（PEDV ）/猪A群轮状病毒（GARV ）/猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）三重联检实时荧光RT-PCR检测试剂盒，猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）荧光定量RT-PCR检测试剂盒，病毒DNA/RNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司），赛默飞荧光定量PCR仪（ABI 7500）,采用实时荧光定量PCR检测方法。对3个猪场挑选20窝腹泻新生仔猪，采集小肠内容物20份进行离心，取上清液200μL制备成20份检测样品。

4.1.1 RNA提取

利用核酸提取试剂盒对20份样品进行RNA核酸提取，分别获得50μL核酸。

4.1.2 PEDV/GARV/TGEV核酸检测

1）取PEDV/GARV/TGEV检测试剂盒，解冻，离心；

2）PCR-MIX配制：21.5μL PCR反应 液+1μL酶 混合 液+0.5内标，混匀，离心，备用；

3）分别向每个PCR管中加入22.5μL的PCR-MIX；

4）分别向反应孔中依次加入2.5μL待检样品核酸模板及阴性和阳性对照；

5）扩 增，设 置FAM检 测PEDV核酸、HEX检测GARV核酸、CY5检测TGEV核酸和ROX检测内标，设置体系25μL。设置扩增程序如表1。

表1 扩增程序

结果判定：

被检测样品检测结果中FAM通道Ct值≤40,扩增曲线为典型的S型扩增曲线，且ROX内标通道Ct值≤35，报告PEDV核酸阳性。

被检测样品检测结果中HEX通道Ct值≤40，扩增曲线为典型的S型扩增曲线，且ROX内标通道Ct值≤35，报告GARV核酸阳性。

被检测样品检测结果中CY5通道Ct值≤40，扩增曲线为典型的S型扩增曲线，且ROX内标通道Ct值≤35，报告TGEV核酸阳性。

4.1.3 PDCoV核酸检测

1）取PDCoV检测试剂盒，解冻，离心；

2）PCR-MIX配制：20μLPCR反应液加1μL酶混合液混匀，离心，备用；

3）分别向每个PCR管中加入21μL的PCR-MIX；

4）分别向反应孔中依次加入4μL4.1.1中的核酸模板及阴性和阳性对照；

5）扩 增，设 置FAM检 测PDCoV核酸，设置扩增程序如表2。

表2 扩增程序

结果判定：被检测样品检测结果中FAM通道Ct值≤35，扩增曲线为典型的S型扩增曲线，报告PDCoV核酸阳性。

4.2 结果

以20份新提取的核酸为模板，进行荧光PCR仪基因扩增：PEDV阳性样本2份，阳性比例10%；GARV阳性样本8份，阳性比例40%；TGEV阳性样本10份，阳性比例50%；PDCoV阳性样本0份，阳性比例0%。

4.3 分析与讨论

通过对3个猪场20窝腹泻仔猪肠道内容物的病原检测，确定送检猪场新生仔猪腹泻病原主要是猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒A群（GARV）。

5 结论

由于黑龙江地区猪场对产房新生仔猪腹泻病原不清，造成防治难度大，治疗成本高，效果不理想。研究选取黑龙江省发生新生仔猪腹泻的3个猪场进行病原调查分析，精心设计试验。对发病场进行大肠杆菌分离、孢球虫检查、猪瘟抗体、猪伪狂犬病野毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测，对猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒进行核酸检测。结合血清学抗体检测、等孢球虫检测、荧光定量PC检测试验结果，确定3个猪场新生仔猪腹泻的病原为猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒。本研究为区域内猪场防治产房新生仔猪腹泻指明了方向，为猪场管理者在后备猪引种驯化、病原净化以及腹泻疫苗的选择提供了参考。