非小细胞肺癌细胞外泌体源性FZD10促进体外血管生成

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有原发肺癌的85%。尽管新的NSCLC治疗方案（如酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗、免疫疗法等）的临床应用已取得了一定的进展，但耐药等因素使其疗效还是没有重大突破，NSCLC患者的死亡率仍然较高。侵袭、转移是导致NSCLC患者死亡的关键因素，而血管生成在NSCLC侵袭、转移中具有重要作用，而且近年来发现外泌体可作为细胞间信息交流的媒介参与NSCLC侵袭、转移及血管生成，从而调控NSCLC的发展。

战士们护着夏国忠冲到江边，把石副连长的命令传达给等候在江边的划夫。几名划夫听说城中还有国军在战斗，自愿要求留下来等候。战士们心里清楚，副连长他们几乎没有了生还的可能，于是不由分说，把几名划夫拉上木排，解开拴在江岸上的麻索，木排在划夫们的操纵下，顺江向下游的烟收坝飞快漂去。

Frizzled-10（FZD10）是G蛋白偶联受体中的一种亚型，在包括肺鳞癌等多种肿瘤组织和细胞中高表达。研究发现FZD10可以通过外泌体为介质促进肿瘤细胞增殖，而且FZD10还被证实在中枢神经系统中与血管生成有关。但FZD10在NSCLC血管生成中的作用尚不清楚，外泌体源性FZD10对肿瘤血管生成的影响还未见报道。因此，本文拟探讨NSCLC细胞来源外泌体中的FZD10（NSCLC 细胞外泌体源性FZD10）对血管生成的影响，以期为NSCLC的防治提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞株及细胞培养

NSCLC细胞株95D（中国科学院细胞库），NSCLC细胞株H1299 和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（ATCC），正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）（赛百慷（上海）生物技术股份有限公司）。95D、H1299 和BEAS-2B细胞使用RPMI 1640+10%胎牛血清（去外泌体血清）+1%青霉素-链霉素培养，HUVEC 使用DMEM+10%胎牛血清（SBI去外泌体血清）+1%青霉素-链霉素培养，所有细胞都在37 ℃、5%CO的条件下传代培养，将处于指数生长期的细胞用作后续实验。

1.2 主要仪器

高速冷冻离心机（HITACHI）；超高速冷冻离心机Optima XPN-100（BECKMAN）；ABI7500型实时荧光定量PCR仪（Thermo）；荧光倒置显微镜TE2000-Nikon公司）；Jem-1400型透射电子显微镜（Jeol）。

1.3 主要试剂

将收集的细胞上清液通过2000离心30 min，取上清液再用10 000离心45 min，再取其上清液用0.22 μm过滤器过滤；过滤后的上清液用超高速（130 000）离心两次，70 min/次，弃掉上清液，外泌体沉淀用PBS重悬（一般情况，100 mL细胞培养上清液提取的外泌体用100 μL的PBS缓冲液重悬）。收集的外泌体可直接用于后续实验，或置-80 ℃冰箱保存1月。

1.4 细胞转染

分别将Opti-MEN基础培养基、5 μmol/L FZD10-siRNA和转染试剂按照表1的体积混合，并按照转染试剂说明书将FZD10-siRNA瞬时转染入95D、H1299细胞，并设转染对照组。

1.5 外泌体提取

兔抗人PI3K 抗体、兔抗人p-PI3K 抗体、兔抗人GAPDH抗体、兔抗人YAP/TAZ抗体、兔抗人p-YAP抗体、兔抗人CD9 抗体、兔抗人Grp94 抗体（CST）；FZD10-siRNA 系列试剂及转染试剂DharmaFECTTransfection Reagents-SiRNA（Thermo）；angiogenesis assay kit ECM 62（Chemicon Millipore)；Angiopoietin-1 (Ang-1) human ELISA kit（RD）；VEGFA Human ELISA Kit、小鼠抗人CD81抗体、兔抗人FZD10抗体、兔抗人TSG101（Abcam）；PKH26红色荧光染料（Sigma）；兔抗人Erk1/2抗体、兔抗人p-Erk1/2抗体、羊抗兔IgG、HRP标记抗体、DAPI染料、裂解液RIPA、Trizol（碧云天生物科技公司）；Matrigel基质胶（BD）；SBI 去外泌体血清（艾博瑞生物科技公司）；SYBRPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）和PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）。

1.6 外泌体形态观察

取10 μL外泌体悬液滴入铜网，室温静置3 min，用等体积的2%醋酸双氧铀染液染色2 min，晾干30 min，使用电压80 kV的JEM-1400型透射电子显微镜观察外泌体的形态，并用Gatan832 CCD相机拍照保存。

1.7 外泌体内化

将95D、H1299、BEAS-2B 细胞外泌体分别和PKH26染料混匀，室温下避光静置5 min，加入等体积的10%BSA终止反应；再重新提取已标记的外泌体并重悬，将标记的外泌体与贴壁的HUVEC细胞共培养6 h，用4%多聚甲醛固定；再用DAPI染料进行细胞核染色，37 ℃温箱中静置10 min，在避光条件下，用荧光显微镜观察外泌体被细胞内化的情况。

1.8 体外成管实验

用Trizol分别裂解95D、H1299、BEAS-2B细胞及不同细胞来源的外泌体预处理的HUVEC，提取总RNA，测定/，通过该比值判断RNA样品的纯度并计算所提取样品的RNA 浓度，计算公式为：C=×0.33×2000 μg/mL。将纯度符合要求（/为1.8～2.0）的样品，按照说明书进行去基因组DNA后，在ABI7500扩增仪上进行RT-qPCR反应。扩增引物序列见表2，所有引物全部由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。逆转录（RT）条件：37 ℃15 min、85 ℃5 s；qPCR反应条件：42 ℃5 min、95 ℃10 s,紧接着40个循环（95 ℃5 s、60 ℃31 s）。结果通过2值对扩增产物进行相对定量分析，将GAPDH作为内参对照。

1.9 Western blot

定向越野运动能促进学生全面发展，在身体条件上提高学生的长跑能力，在心理上提高学生的耐力及团队合作能力，从而使其在毕业时能更快地适应社会。

本研究有一定的局限性需要指出。研究收录部分老年患者，这些人存在二尖瓣退行性变的风险。血流频谱E/A作为判断左心室舒张功能不全的指标存在假阴性的可能，不能完全确定患者心脏的舒张功能。另外本研究连续选取完成睡眠呼吸检测和超声心动图的患者，入选过程可能存在偏倚。例如临床出现心力衰竭症状的患者更容易被建议接受超声检查；因此入选的研究对象心力衰竭诊断率高于普通住院患者，研究结果难以推广到一般人群。同时，由于接受睡眠呼吸检测的患者多已被疑诊睡眠呼吸紊乱，因此研究对象SA检出率过高也限制了研究结论的推广。

1.10 RT-qPCR

根据Chemicon（Millipore）的angiogenesis assay kit说明书操作。主要步骤：将基质胶放在4 ℃冰箱过夜融化并按照10×稀释液:基质胶=1∶9的比例稀释，用预冷的移液器取50 μL的基质胶包被96孔板，静置1 h使其凝固；预先按照2×10/孔将HUVEC细胞接种在六孔板中，用50 μg不同细胞来源的外泌体（NSCLC细胞、FZD10敲低的NSCLC细胞来源的外泌体）分别处理HUVEC 细胞48 h，消化、重悬后以细胞总数为8000～10 000且细胞悬液体积不超过150 μL的HUVEC细胞接种到已凝固的基质胶上，培养6～8 h，于倒置显微镜下观察成管情况，使用软件Scion Image分析结果并计算成管总长度。

1.11 ELISA实验

按照说明书，采用ELISA 法检测NSCLC 细胞、FZD10敲低的NSCLC细胞来源的外泌体分别处理后的HUVEC条件培养基中VEGFA和Ang-1的浓度，检测前需稀释样品到合适浓度，再在波长450 nm的分光光度计中读取吸光度值，使用软件ELISA CALC分析数据并计算浓度值。

1.12 统计学分析

通过电子显微镜观察发现，采用超速离心法所分离的物质为单个或聚集成团的膜性结构囊泡，呈现较典型的外泌体形态特征（图1A）；利用Western blot鉴定发现，外泌体相关标志物CD81、CD9和TSG101均可在所提取的物质中表达，而内质网分子伴侣相关蛋白Grp94（非外泌体相关标志物）却不存在于所提取的物质中（图1B）。说明本研究利用超速离心法从细胞上清液中分离出的物质是外泌体。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定

使用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计学分析。所有实验都重复3次，数据均用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本检验；多组间比较采用单因素方差分析，多组组间两两比较方差齐时采用LSD检验。＜0.05 表示差异具有统计学意义。

使用强RIPA分别裂解细胞及其外泌体，提取总蛋白，使用BCA法检测蛋白原液浓度，再加热变性（CD81无需加热变性），除Erk1/2、p-Erk1/2分析取12 μg外，其余取50 μg上样、电泳（60 V浓缩30 min，再100 V电泳约1.5 h）、转膜、电转（100 V电转1.5 h）、封闭。加入一抗4 ℃孵育过夜（除兔抗人Erk1/2抗体和兔抗人p-Erk1/2抗体按1∶2000稀释外，其他一抗均按1∶1000稀释），洗涤后，再加入二抗室温孵育1～2 h（二抗全部按1∶2000稀释）。用ECL化学发光检测信号，条带结果用Image J软件进行灰度值分析。将GAPDH作为内参对照。

2.2 FZD10在NSCLC细胞及其外泌体中的表达

Western blot结果显示，与BEAS-2B细胞及其外泌体相比较，95D、H1299细胞中的FZD10蛋白水平升高（＜0.01），且两株NSCLC细胞来源的外泌体中也均有FZD10蛋白的高表达（图2A、B）；RT-qPCR结果显示，两株NSCLC细胞中的FZD10 mRNA表达也高于对照细胞BEAS-2B（＜0.01，图2C）。

2.3 NSCLC细胞来源的外泌体促进体外血管生成

外泌体内化结果显示，被标记的外泌体基本绕HUVEC细胞核单个或多个分布（图3），HUVEC均可内化95D、H1299和BEAS-2B三种细胞来源的外泌体；体外成管实验结果显示：与BEAS-2B细胞来源的外泌体处理组相比较，95D、H1299 两株NSCLC 细胞来源的外泌体处理组的HUVEC总管长度明显增加（＜0.01，图4A、B）。ELISA检测和RT-qPCR分别从蛋白水平和mRNA转录水平证实，95D、H1299两株NSCLC细胞来源的外泌体明显促进了HUVEC 中的血管生成相关标志物VEGFA 和Ang-1 的蛋白分泌和mRNA 表达（＜0.01，图4C～E）。

与95D exo对照组比较，95D FZD10-KD exo处理组p-PI3K和p-Erk1/2的表达明显下调（＜0.05，图6A）；与H1299 exo对照组比较，H1299 FZD10-KD exo处理组p-PI3K和p-Erk1/2的表达降低（＜0.05，图6B）。但YAP/TAZ信号通路相关分子表达差异不显著（＜0.05，图6）。

2.4 NSCLC细胞来源的外泌体通过FZD10促进体外血管生成

FZD10表达在95D、H1299细胞中被成功敲低（图5A），FZD10敲低的NSCLC 细胞来源的外泌体处理组（95D FZD10-KD exo、H1299 FZD10-KD exo）的HUVEC成管能力与FZD10未敲低的NSCLC细胞来源的外泌体处理组（95D exo、H1299 exo）相比明显降低，两组结果的总管长度差异具有统计学意义（＜0.01，图5B、C）。ELISA的检测结果显示：与95D exo处理组比较，95D FZD10-KD exo处理组的细胞条件培养液中血管生成相关标志物VEGFA和Ang-1浓度均明显降低（＜0.01，图5D、E）。RT-qPCR 的结果也显示，95D FZD10-KD exo处理组细胞的VEGFA和Ang-1 mRNA表达水平也明显低于95D exo处理组（＜0.01，图5F）。

2.5 NSCLC细胞外泌体源性FZD10促进血管生成的分子机制

1.在我国经济发展日益成熟的今天，特别是我国参与国际贸易活动且不断深化之后，知识经济作为一种大的国际环境，已然发展成为当前企业在构建现代化经济体系时所需要的重要资源。那些掌握了知识经济的企业，在国际市场上占据了领头地位。这些企业只需要向其他企业出口知识或者专利，就能获取高额收益，而那些使用这些知识资源的企业，也仅仅是在挣份辛苦钱。不仅如此，在未来，随着信息化、智能化的进一步成熟，知识在未来社会发展过程中的地位将会更加牢固，有了知识技术优势的企业，将会更有优势。而那些知识信息严重匮乏的企业，将更加难以生存。

3 讨论

外泌体是由体内多种活细胞分泌的直径在30～150 nm的细胞外囊泡，其可作为细胞间通讯的重要桥梁，在NSCLC生长、侵袭、转移、上皮-间质转化、耐药等中起重要作用，而且还发现外泌体可参与调控NSCLC血管生成。FZD10是经典通路Wnt/βcatenin中的重要受体，其为影响肿瘤治疗效果的关键分子，可能为肿瘤防治的重要靶点。近年发现，结肠癌细胞株来源的外泌体通过递送FZD10诱导了正常结肠上皮细胞株发生上皮-间质转化，而且FZD10外囊泡血浆浓度还与结直肠癌和胃癌发展有关。这些报道说明FZD10可能可通过外泌体递送在肿瘤发展中发挥作用，但FZD10是否可通过外泌体递送在NSCLC发展中发挥作用还未见文献报道。

三是大力要求提高国家文化软实力。文化软实力集中体现一个国家基于文化而具有的凝聚力和生命力，以及由此产生的吸引力和影响力。习近平指出，提高国家文化软实力，关系我国在世界文化格局中的定位，关系我国国际地位和国际影响力，关系“两个一百年”奋斗目标和中华民族伟大复兴中国梦的实现。据此，首先需要深化文化体制改革，推动文化事业和文化产业的发展，更好构筑中国精神、中国价值、中国力量，夯实国家文化软实力的根基。同时，也要“不忘本来、吸收外来、面向未来”，着力扩大中华文化影响，推进国际传播能力建设，增强对外话语的创造力、感召力、公信力，讲好中国故事，让世界了解一个多面的透底的真实的中国。

本研究发现FZD10 不仅在NSCLC 细胞（95D 和H1299）中高表达，而且在其外泌体中也呈现高表达。与正常人支气管上皮细胞BEAS-2B来源的外泌体相比较，95D 和H1299 细胞来源的外泌体可明显促进HUVEC细胞管状样结构的形成及血管生成相关因子VEGF、Ang-1的蛋白分泌和mRNA表达（＜0.01），说明NSCLC细胞（95D和H1299）来源的外泌体可促进血管生成；但FZD10敲低后，95D 和H1299细胞来源的外泌体对HUVEC 细胞管状样结构的形成及VEGF、Ang-1的蛋白分泌和mRNA表达的影响也受到了抑制（＜0.01），说明FZD10可通过外泌体递送介导NSCLC血管生成，从而在NSCLC发展中起重要作用。因此，FZD10可能是NSCLC防治的潜在靶点。

为进一步探讨外泌体源性FZD10在NSCLC血管生成的作用机制，本研究对PI3K、Erk1/2、YAP/TAZ多条信号通路进行了初步分析。最近有研究报道在结肠癌和胃癌中外泌体源性FZD10通过Erk1/2信号通路增强了Ki-67的表达。本研究结果也显示，FZD10敲低的95D和H1299细胞来源的外泌体可抑制PI3K、Erk1/2信号通路的激活，说明PI3K、Erk1/2信号通路可能参与了外泌体源性FZD10促进NSCLC血管生成的过程。有研究在中枢神经系统血管生成中发现FZD10以Gα 12/13依赖的方式诱导了YAP/TAZ 的转录激活，但本研究在对FZD10敲低和未敲低95D和H1299细胞来源的外泌体YAP/TAZ及p-YAP表达的比较分析中，未发现YAP/TAZ 信号通路参与外泌体源性FZD10 促进NSCLC血管生成过程的调控，我们的结果与中枢神经系统模型结果的差异可能由于细胞种类的不同及肿瘤微环境的复杂性所致。

数据显示，2017年四川省完成地区生产总值3.70万亿元。其中，成都以1.39万亿元，占比达到37%，可谓遥遥领先。排行第二的绵阳GDP总量为2074.8亿元，成为四川首个跨过2000亿门槛的地级市。德阳、宜宾、南充则紧随其后，逼近2000亿大关。在“1500亿”一档的泸州、达州、乐山差距并不大。

基于目前FZD10 在NSCLC 研究罕见，尤其是NSCLC细胞外泌体源性FZD10在血管生成中的研究在我们所能检索的资料范围之内未见报道，本研究不仅明确了FZD10在NSCLC细胞及其外泌体中高表达，而且还发现NSCLC细胞来源的FZD10通过外泌体递送介导体外血管生成。本研究的优势是将FZD10与血管生成之间的作用通过外泌体将两者联系起来，可进一步阐明FZD10 在NSCLC 发展中的作用机制，并可为NSCLC防治潜在靶点FZD10的发现提供实验依据。