CD40LG是与浸润性乳腺癌肿瘤微环境中免疫和基质相关的预后标志物

乳腺癌是世界上女性最常见的癌症类型之一，也是癌症相关死亡的主要原因。尽管随着技术的发展，乳腺癌的治疗取得了很大的进步，但它仍然是女性恶性肿瘤的常见死因。研究表明仅靠临床病理特征不能为乳腺癌患者提供准确的预后信息，从而导致过度或不充分的治疗。新的证据表明，使用肿瘤微环境（TME）相关免疫评分和TME中肿瘤浸润性免疫细胞（TIC）的比例提高了TNM分期系统的预测效率。TME由肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、细胞外基质（ECM）、信号分子和细胞因子组成，其中免疫细胞可以影响肿瘤的生长。同时，基因表达异常与表观遗传学改变显著相关，表达特征可预测临床结果。因此，寻找一种可以预测癌症预后的生物标志物成为研究的热点。

研究显示目前已有CD2、CD52及ITK等基因被证实是乳腺癌免疫相关的预后因子。有研究表明CD40LG修饰的肺癌细胞外泌体能有效激活树突状细胞，抑制肺癌的进展，延长小鼠的生存时间。通过整合的生物信息学分析确定了CD40LG是乳腺癌的另一个免疫和TME调节密切相关的预后基因。但已有的研究缺乏相关的临床实验验证。

本研究从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库下载乳腺癌转录组RNA-seq数据和临床相关数据，并在临床收集乳腺癌组织及癌旁组织。通过一系列生物信息学分析，11 个基因被认为是乳腺癌的预后基因，其中CD40LG对乳腺癌患者的总生存期和临床预后具有很大的预测价值，进一步运用Western blot和qRT-PCR法进行临床验证，证实CD40LG 在癌旁组织中高表达。CD40LG在TME中高表达与生存呈正相关，可能成为乳腺癌患者新的预后生物标志物和治疗靶点。

1 资料和方法

1.1 数据收集与处理

1.1.1 临床资料 从宁夏医科大学总医院肿瘤医院收集2021年1月～2022年1月行乳腺癌改良根治术患者的癌组织24例和相对应的癌旁组织24例为研究对象，患者均为女性，平均年龄51岁。纳入标准：所有患者均经组织病理学确诊为浸润性乳腺癌；癌组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘大于5 cm）均取自同一确诊乳腺癌患者。排除标准：术前行新辅助治疗，如化疗、放疗等；本研究已通过宁夏医科大学总医院医学伦理委员会审查。

1.1.2 数据库资料 本研究通过从癌症基因组图谱（TCGA）(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)下载乳腺癌数据集，获得了1 222个转录组RNA测序数据和临床数据（124个正常样本和1098个肿瘤样本）。在排除没有随访信息及随访时间较短的患者后，选择了1046名患者进行进一步分析。应用Estimate R软件包中的Expression Data（Estimate）算法，以免疫评分（Immune Score）、基质评分（Stromal Score）和总评分（Estimate Score）3个分数的形式对各样本的免疫成分和基质成分在TME中所占的比例进行估计，得分越高，相应成分在TME中所占的比例越大。

1.2 TME相关性分析

根据Stromal Score和Immune Score的中位数，将患者分为高、低基质评分组和高、低免疫评分组，以总生存期（OS）为主要终点，用Kaplan-Meier（KM）生存分析判断高、低基质和免疫评分组之间是否存在差异，亚组间比较采用对数秩检验，＜0.05 认为差异有统计学意义。采用Kruskal-Wallis 秩和检验评价Stromal Score、Immune Score和Estimate Score评分在年龄、性别、病理分期、T分期、N分期和M分期上是否存在差异，＜0.05时认为差异有统计学意义。

1.3 鉴定差异表达基因（DEGs）

按高分和低分分组，采用“LIMMA”软件包进行筛查。筛选条件设置：|log2(FC)|＞1和调整后的错误发现率（FDR）＜0.05。用R 语言的pheatmap 软件包绘制DEGs 的热图。用clusterProfile、richlot和ggplot2R软件包对DEGs进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）的富集分析并作图，＜0.05和Q＜0.05的富集项目具有统计学意义，结果用气泡图和圆圈图可视化。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）使用交互置信度大于0.95的节点来构建网络。红色代表上调基因，绿色代表下调基因，利用Cytoscape中的CytosHubba插件进行模块分析，根据多网络聚类（MNC）的方法筛选出前30个有意义的基因。

1.4 单因素COX回归分析

为了确定哪些DEGs 与OS 相关，我们使用“survival”R包进行单变量COX回归分析，确定与总生存期相关的基因（＜0.05）。

1.5 CD40LG差异表达及生存分析

采用GSEAv4.1.0 软件进行基因集富集分析（GSEA），确定CD40LG 高、低表达的相关生物学通路。当＜0.05时，认为该通路显著富集。

1.6 GSEA（Gene Set EnrichmentAnalysis）分析

通过“bee colony”和“ggpubr”R 软件包，采用Wilcoxon 秩和检验比较肿瘤组织和正常组织中CD40LG mRNA的表达。根据表达中位数将样本分为高表达组和低表达组，两组均采用“survival”R包进行生存分析。通过“ggpubr”R软件包采用Kruskal-Wallis秩和检验进行临床相关性分析，评价CD40LG表达与病理分期、T分期、M分期、N分期的关系。

1.7 免疫细胞浸润的计算

玉米膜下滴灌高产栽培技术是覆盖、灌溉、高产技术相结合的综合技术。为了合理实施该技术，需要在种植初期进行一系列的前期准备工作，在正式实施中，中后期滴灌管网的布设和田间管理尤为重要，加强灌区灌溉管理。积极开展化肥和施肥管理，从多个方面进行病虫害防治，提高玉米产量。

1.8 Western blot实验

主要试剂：乳腺细胞（MCF10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SK-BR-3、BT-474）（赛库生物），液氮保存。兔抗人CD40LG单克隆抗体及山羊抗兔二抗（Proteintech）；蛋白总浓度测定（BCA法）蛋白定量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒和SDS-PAGE 凝胶试剂盒均（南京凯基生物）。

使用CIBERSORT计算方法来估计肿瘤免疫细胞（即TICs）在所有肿瘤样本中丰度分布的比例，并使用柱状图可视化。采用Wilcoxon 秩和检验比较CD40LG高、低表达肿瘤组织中CD40LG 表达的比例，并评价CD40LG表达与肿瘤组织比例之间的Pearson相关性。使用“violot”、“ggplot22”和“ggpubr”R软件包制作散点图和小提琴图。

初中阶段的学生在个性和思维等方面有着一定的独特性，在教学过程中他们常常会脱离教学本质，并且有着好动的特征。教师要正确引导，善于运用合适的方法和手段吸引学生注意力，从而达到预期的效果。更重要的是，教师应该积极探索，结合实际，找出适合自己的一套教学方法，因材施教，形成优秀的教学能力，培养更多的人才。

首先进行试剂配置及器皿处理，细胞处理同上；分别提取乳腺正常细胞及乳腺癌细胞和癌组织及癌旁组织中总RNA，并对提取的RNA 进行质量检测；根据RNA反转录试剂盒的步骤逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，按照公司说明书操作配制反应体系，将U6作为内参，实验结果采用2法进行表达量相对定量分析。qRT-PCR 引物序列：CD40LG 上游引物：5'-AATACCCACAGTTCCGCCAAACC-3'；下游引物：5'-CATTGACAAACACCGAAGCACCTG-3'；U6 上游引物：5'-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3'，下游引物:5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

响应曲面优化设计中，模型的准确性直接影响实验的真实误差以及最终结论。利用方差分析回归方程中系数的显著性可以进一步判断模型的有效性[12]，模型可信度及方差分析结果分别见表3和表4。

我们的研究显示，CD40LG在正常组织和配对组织中的表达明显高于肿瘤样本（＜0.05，图6A、B）。根据CD40LG中位表达情况，将肿瘤标本分为高表达组和低表达组。与CD40LG低表达组相比，BRCA患者高表达组OS显著延长（图6C）。在临床病理分析中，CD40LG表达与病理分期、T分期显著相关。CD40LG在TNMⅣ期的表达低于其他分期（Ⅳ期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，值分别为0.021、0.046、0.021)（图6D）。同样，CD40LG的表达也与T分期呈负相关（T4T1、T2、T3，值分别为0.0024、0.01、0.0037）（图6E）。但在N分期和M分期两组间差异无统计学意义（＞0.05，图6F、G）。

1.9 qRT-PCR 法

从液氮罐中取出BRCA患者的癌组织及癌旁组织标本，手工充分磨碎后离心取上清液，通过蛋白总浓度测定（BCA法）测蛋白浓度。8%SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭60 min；放入一抗工作液，4℃孵育过夜；TBST洗膜，5 min×5次；放入相应二抗工作液中，室温60 min；TBST洗膜，5 min×5次；通过ECL显影，用Image J软件对条带进行灰度值检测，结果用计算公式：目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白吸光度值/β-Actin吸光度值。从液氮中取出细胞，解冻后进行离心、培养，将收取的细胞用蛋白裂解液充分裂解提取细胞总蛋白，严格按照全蛋白提取试剂盒操作，后续操作同上。

2 结果

为了确定TME中免疫成分和基质成分之间的差异，我们分析了TCGA数据库中1046例BRCA患者的转录组数据，并比较了ImmuneScore 高低组和StromalScore组之间的基因表达，ImmuneScore高组和低组之间有1446 个DEGs（1256 个上调，190 个下调）（图4A、B），StromalScore高、低组之间有1330个DEGs（1118个上调，212个下调）（图4C、D）。分别于两组中上调（图4E）和下调（图4F）基因取交集，最终获得487个共享DEGs（其中447个上调，40个下调）。

团员青年代表黄捷、劳动模范代表黄红雄、科技人员代表李雪梅在发言中表示，将继承老一辈人的优秀传统，承担起集团未来发展的重任，用自己的努力创造华谊新的辉煌。

2.1 ImmuneScore与乳腺癌患者生存率相关

根据各评分中位数（ImmuneScore、StromalScore、EstimatScore）将1046 份BRCA 样本分为高、低评分组。采用Kaplan-Meier生存分析，探讨各评分与总生存率的相关性。结果显示，免疫评分与OS显著相关，评分高的患者生存率高于评分低的患者（=0.011，图2A）。然而，患者的StromalScore、EstimatScore和OS之间无显著差异（图2B、C）。

2.2 ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore与临床病理特征的关系

为了确定免疫成分和基质成分的比例与临床病理特征之间的关系，我们从TCGA数据库中分析了BRCA样本的临床信息，包括年龄、性别、原发肿瘤大小（T分期）、区域淋巴结状态（N分期）、远处转移（M分期）和病理分期。ImmuneScore 与年龄、性别显著相关（=0.048；=0.014），但在T分期、N分期、M分期及病理分期中差异无统计学意义（＞0.05，图3A）。StromalScore与年龄（=0.033）、T 分期、N 分期、II 期与I 期（=0.0082）、II期与III期（=0.0077）相关，但与性别和M期无显著相关性（＞0.05，图3B）。EstimateScore与N分期、M分期、病理分期差异均无统计学意义（＞0.05），与年龄、性别、T分期相关性显著（图3C）。

2.3 共享DEGs主要富含免疫相关功能

图1是本研究的流程图。我们从TCGA数据库中提取了转录组数据和临床数据（表1），包括124个正常样本和1098个肿瘤样本。临床数据包括年龄、性别、TNM分期、T分期、N分期、M分期及总生存期和生存状态。利用ESTIMATE和CIBERSORT算法对转录组数据进行分析。通过在高、低Immune Score组和Stromal Score组之间取交集获得了DEGs。建立PPI网络，进行单因素COX回归分析，并对网络核心基因和存活相关基因取交集，共获得了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52、CD27 等11 个预后基因。我们选择CD40LG进行了进一步的分析，包括差异表达分析、生存分析、临床相关性分析和GSEA富集分析。最后运用Western blot实验和qRT-PCR法分别验证CD40LG在乳腺正常细胞及不同乳腺癌细胞和BRCA组织及癌旁组织中的表达水平。

利用GO和KEGG对这些共享基因进行分析，预测其功能。GO富集分析结果表明，DEGs主要富集在免疫应答激活细胞表面受体和淋巴细胞免疫等免疫相关信号通路中（图4G）。KEGG富集分析表明，DEGs富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞黏附分子、造血细胞系等（图4H）。

从图2看出，受成土母质、风化条件等因素的影响,台子村农田土壤中富含钙质,所有样点的钙质含量均处于高水平梯度，74.9%的样点土壤镁含量居中等水平,23.4%的样点处于高水平,但台子村亦存在少量的土壤低镁区。硫作为一种主要的中量营养元素,在干旱的石灰性土壤中主要以无机硫形态存在，相对于南方,北方土壤更易产生缺硫现象,台子村75.4%的样点处于缺硫状态,处于中等水平的样点占总样点数的15.6%(图2)。加强作物硫营养与改善农产品品质,如提高氨基酸、蛋白质及油料作物油分含量,充足的硫营养有利于作物对水分的高效利用。因此,台子村在施肥时应着重考虑加大硫肥的施用,以防出现缺硫病征。

2.4 通过PPI 网络和单变量COX 回归分析获得预后基因

利用487个DEGs通过STRING数据库建立PPI网络，最小置信值为0.9，由Cytoscape软件显示（图5A）。然后按照节点数的顺序得到前30 个网络核心基因（5B）。为了确定提取的基因是否为影响乳腺癌预后的关键基因，对487个DEGs进行单因素COX回归分析，截断值＜0.05（图5C）。最后，通过对PPI网络中前30个网络核心基因和单变量COX回归分析的结果取交集（图5D），获得了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52、CD27共11个预后基因。

2.5 CD40LG的差异表达、生存分析及临床病理特征分析

我国非常重视农业的发展，出台了一系列惠民政策。农业节水灌溉技术的出现，使这些惠民政策减少了在灌溉方面的帮扶，增加了农业其他方面的帮扶，推动了农业的发展，促进了农业经济的增长。

2.6 CD40LG相关的生物学途径

GSEA 用于研究CD40LG 表达的生物学途径，CD40LG的高表达主要集中在免疫相关通路（图7），如B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路等。

2.7 CD40LG表达与TICs的关系

CD40LG高表达组和低表达组共获得22种免疫细胞（图8A）。通过差异分析和相关分析，发现14种免疫细胞与CD40LG的表达有关，包括B细胞、T细胞CD8、T细胞CD4记忆静息、T细胞CD4记忆激活、T细胞滤泡辅助细胞、T细胞调节因子（Tregs）、T细胞γδ、NK细胞静息、巨噬细胞M0、M1、M2、树突状细胞静息、肥大细胞静息、中性粒细胞。

1.4.3 血脂相关指标 比较两组治疗前后总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL‐C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL‐C）的变化，以上血脂相关指标使用酶联免疫法（ELISA）测定。

2.8 实验测定CD40LG在细胞及临床标本中的表达

qRT-PCR显示，CD40LG在BRCA组织中mRNA表达水平显著低于癌旁组织（＜0.05，图9A）；同时，Western blot结果显示，CD40LG在BRCA组织中蛋白表达水平也显著低于癌旁组织（＜0.05，图9B、C）。

3 讨论

越来越多的证据表明，分子靶向治疗是肿瘤治疗的一个很有前途的研究方向，因此迫切需要探索乳腺癌发生发展的详细分子机制。目前，TME的研究因其在治疗和预后方面的重要意义而成为研究热点，乳腺癌的TME也引起了许多专家的关注。

本研究的目的是基于CIBERSORT和ESTIMATE两种算法，试图确定与BRCA 患者肿瘤发生相关的TME核心基因，并可能成为临床治疗的靶点。通过综合生物信息学分析，我们得到了以下结果：ImmuneScore与BRCA患者的OS显著相关，评分高的患者生存率高于评分低的患者；StromalScore与T分期、N 分期及病理分期有关，ImmuneScore 及ESTIMATEScore与年龄、性别相关；DEGs主要富集在免疫相关的信号通路中；CD40LG在正常及配对组织中的表达高于肿瘤组织；高表达组患者的OS优于低表达组，且CD40LG在TNM Ⅳ期和T分期T4期的表达均低于其他各分期；通过差异分析及相关性分析，我们发现14种免疫细胞与CD40LG表达相关。

尽管已有的研究表明CD40LG是BRCA患者有价值的预后分子标志物，其低表达与预后不良有关，但缺乏相关的临床实验验证，我们的研究从细胞和组织两个层面验证了CD40LG在BRCA中的表达水平；其次，Yuan等只关注了免疫成分在乳腺癌中的作用，而忽视了基质成分，本研究发现StromalScore与BRCA患者的临床病理特征也具有相关性。

综放工作面过渡液压支架增高装置分两部分：底座和顶梁。两部分结构采用光销和D型销进行连接，组装好后以“戴帽子”的形式安装到工作面上端头过渡液压支架上增高，因此命名为增高装置。其中底座的主要作用是和过渡液压支架连接，并为顶梁提供连接和支撑，因此底座的形状和过渡液压支架顶部的形状几乎完全相同，规格比支架顶部略大，保证支架可以将“帽子”戴上，通过预留的孔眼使用铁链螺栓等固定牢固；顶梁的形状类似一个小支架，以方便将顶板支护完全，可使支架的支护高度由原来的最大2.8m提高到4.3m。具体参数如下：

ESTIMATE 算法可以预测肿瘤纯度并使用ImmuneScore和StromalScore描述肿瘤组织中浸润的免疫细胞、基质细胞的比例。基于TCGA转录组数据，我们观察到高ImmuneScore组患者的OS显著延长，这表明免疫成分是预测预后的潜在因素。这与以往的研究一致。已发表的研究表明，在结肠癌中ImmuneScore是预测结肠癌患者复发风险的可靠、有效的临床方法，其对预后的评估优于包括TNM、MSI在内的其他预后因素。在临床相关性方面，本研究显示StromalScore与T分期、N分期及TNM分期有关，这提示基质细胞含量在一定程度上影响着乳腺癌的侵袭、迁移等方面的病程发展。在乳腺癌的小鼠模型中，基质细胞的生长促进作用因糖酵解抑制而受损，表明基质通过分泌乳酸盐为恶性细胞提供营养支持。但值得注意的是ImmuneScore与患者的各分期并不相关，考虑可能是由不同肿瘤阶段免疫细胞浸润类型的差异导致的。

通过GO及KEGG富集分析发现DEGs主要富集在免疫相关的途径中。为了进一步研究预后基因，我们建立了PPI网络，并用DEGs进行了单变量COX回归分析，在此基础上确定了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52和CD2711个预后基因。因CD40LG的HR最小，提示可能是更好的保护因素，所以选择该基因作进一步分析。

植物诱抗剂-IR-18对向日葵列当的抑制效果及应用…………… 云晓鹏，杜 磊，白全江，孙 涛，田晓燕，苏雅杰，张 光（77）

CD40LG是与CD40结合的细胞因子，一种Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）基因超家族。CD40-CD40LG相互作用是B细胞增殖、活化标志物表达、免疫球蛋白产生和同型转换的重要信号，可直接抑制CD40阳性癌细胞的生长，并可能通过协调免疫反应间接抑制肿瘤的生长。本研究中CD40LG在正常及配对组织中的表达高于肿瘤组织，且其高表达BRCA患者的OS显著延长；通过qRT-PCR和Western blot实验也证实了癌组织中的CD40LG在mRNA和蛋白水平的表达低于癌旁组织。有研究报道了一种利用神经干细胞的肿瘤归巢特性将CD40LG分子运送到肿瘤组织中的治疗方法，即用编码CD40LG的杆状病毒载体体外转导，静脉注射到免疫活性良好的原位乳腺癌和转移性乳腺癌小鼠体内，发现治疗阻碍了肿瘤的生长，使荷瘤小鼠的存活时间延长。在临床病理特征方面，CD40LG在TNM Ⅳ期和T分期T4期的表达均低于其他各期，表明CD40LG的低表达可能与BRCA的侵袭和转移密切相关，导致预后不良。

为了探讨CD40LG表达与BRCA患者TME的关系，我们进行了GSEA富集分析。分析发现CD40LG高表达主要涉及免疫相关信号通路，如B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路等。这些结果证实了CD40LG 可以通过不同的途径调控BRCA 的免疫细胞。此后，通过CIBERSORT计算方法从BRCA样本中获得了22种免疫细胞，其中14种与CD40LG的表达相关。这表明CD40LG的生物学行为取决于表达水平和TIC表型，这可能为靶向治疗和分子生物学进展提供新的见解。但具体的作用机制目前并不清楚，有待进一步的研究。

综上所述，本研究采用多种算法证实TME中免疫成分高的BRCA患者具有更好的总生存期。此外，我们还筛选出了一个免疫相关基因CD40LG，该基因在TME中高表达与BRCA患者的生存呈正相关，且临床实验证实与癌组织相比，CD40LG在正常组织中高表达。因此，CD40LG可能是一种新的用于预后预测的生物标志物。另外，CD40LG主要富集在免疫相关的信号通路中，有望成为免疫治疗的靶点。