MiRNA-26a通过调控结缔组织生长因子缓解血管平滑肌细胞的钙化

血管钙化是动脉粥样硬化、高血压、血管损伤等普遍存在的病理表现。其主要特征为血管壁僵硬性增加，顺应性降低，易导致心肌缺血、左心室肥大和心力衰竭，引发血栓形成、斑块破裂，是心脑血管疾病高发病率和高死亡率的重要因素之一。结缔组织生长因子（CTGF）是一种富含半胱氨酸的多肽，在调节细胞外基质蛋白、促纤维化因子和血管生成因子中起重要作用。这种肽可以从各种细胞系中释放，包括纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞。MicroRNA是一个小的非编码单链RNA家族，为了调节靶基因的表达，miRNA可以与特定的3'非翻译区（3'UTR）结合。许多研究报道，miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡、激素分泌和个体发育等生物学活动。据报道miRNA-26a在不同来源的细胞类型中对细胞命运和存活产生不同的影响。miRNA-26a被认为是骨骼肌生成的有效诱导剂和增殖性肝细胞癌和淋巴瘤细胞中细胞周期停滞的促进剂。miRNA-26a能够促进血管平滑肌细胞增殖，同时抑制细胞分化和凋亡，并改变TGF-β途径的信号传导。然而miRNA-26a在血管钙化过程中是否作用于其他基因并发挥调节作用还未见报道。本实验通过调节结缔组织生长因子研究miRNA-26a对血管平滑肌细胞钙化的影响，明确miRNA-26a在血管平滑肌细胞钙化中的作用。以期为血管平滑肌细胞钙化的治疗提供新的理论依据及治疗思路。

图纸会审工作对工程质量有着直接影响，要引起足够的重视。在审查过程中，一定要注意细节方面，避免出现的错误，将所有问题都解决掉，真正意义上做到万无一失。过程中要做好记录，发现其中存在不足地方，便于后期的完善，从而提高图纸的科学合理性，为施工提供正确的指导，确保在工期之内完成。另外造价预算也是很重要的，制定一份详细计划，对资金进行合理分配，保证发挥出有效的作用，防止前期投入过多，后期施工出现麻烦等问题。会审人员要认真负责，树立起求真务实的态度，再小的问题都要处理，为施工开展做好充足的准备。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7r5，购买于中科院上海细胞库。DMEM（Gibco，C11995500BT）；胎牛血清（TBD，TBD11HT）；PBA、0.25%胰蛋白酶（雷根）；BGP（Sigma）；甲醛（麦克林）；茜素红法钙质染色试剂盒（上海歌凡）；Trizol（Ambion）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；Ologi (dT) 18 Premer、PrimeScript IIRTase、Recombinant Rnase Inhibitor（TAKARA）；碱性磷酸酶（ALP）测试盒（南京建成，A059-1-1）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（solarbio），兔抗OPG、OPN、BMP-2、Collagen II（Abcam）；兔抗GAPDH和HRP标记的山羊抗兔IgG（bioswamp）。

1.2 方法

1.2.1 A7r5 钙化模型构建 A7r5 细胞在含10%FBS的DMEM培养基37 ℃、5%CO中培养。当细胞生长达到80%汇合时，胰蛋白酶消化后收集细胞调整细胞悬液浓度，接种于12 孔板中培养过夜。钙化培养基（CM；DMEM补充有10 mmol/L β-甘油磷酸盐（BGP）和3 mmol/L CaCl诱导VSMC 细胞钙化，诱导0、12、24、48、72 h后进行后续检测。

1.2.2 转染miRNA-26a mimic和inhibitor及效率鉴定转染前24 h，在2 mL完全培养基中接种5×10细胞，种于6 孔板，转染时细胞融合度为90%。取100 pmol miRNA稀释于250 μL Opti-MEM中，轻轻吹吸5次混匀。取5 μL LipofectamineRNAiMAX稀释于250 μL Opti-MEM 中，将两液体混匀，室温孵育20 min。将500 μL复合物加到细胞中，摇晃细胞培养板。转染4 h后换新鲜培养基，培养24 h。RT-PCR检测转染效率。

1.2.3 实验分组及处理 将细胞分为5 组：正常对照组细胞正常培养基培养；模型组VSMC 细胞诱导钙化；模型+AR234960组的VSMC细胞诱导钙化后，加入10 μmol·L的AR234960 激动剂干预12 h；AR234960+miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后，先用10 μmol·L的AR234960激动剂处理12 h，再转染miR-26a mimic；miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后转染mimic。

社会实践是高校人才培养过程中不可或缺的一个环节,实践基地为学生将来顺利适应社会提供了重要平台。高校应该与用人单位建立长期的联系，通过与城市街道、企事业单位、社会机构等的联系，探索有利于帮助学生提高社会竞争力的合作方式，建立一批有法律保障的、稳定地、可持续的社会实践基地。另外,还可以聘请一些优秀教师共同参与,为社会实践基地的建设提供技术服务和智力支持。

1.2.9 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示。多组间比较使用单因素方差分析。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

除公共课和理论性很强的基础课外，其他课程都是校企双方共同授课，校内教师讲授基本理论，企业老师讲授专业技能。以草坪养护方向的核心课程《高尔夫球场草坪建植与养护》为例，本门课程理论部分由校内教师讲授，实践部分在企业完成，学生学到的不是单一的操作技能，而是整个草坪建植养护的综合技能，经过一个周期的学习，真正做到了理论和实践相结合，在掌握了高尔夫球场草坪草养护要点的基础上，理解了草坪草生长规律，掌握了各项操作技能，为今后从事各类草坪养护奠定了基础。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒步骤检测蛋白浓度，按照每孔20 μg蛋白上样电泳，结束后湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加入一抗稀释液，室温孵育1 h，PBST洗膜3次后加入二抗稀释液，室温孵育1 h后洗膜，ECL显影，TANON GIS软件读取灰度值。

基层协商民主需要技术和资源的支撑，社区资源有限，加之政府在搭建资源筹集平台上支持力度不够，使收集民意信息网络运行效率不高，不仅协商结果难以落实，还造成了部分社区居民习惯于组织安排，不善于自己发表意见，更有部分城市社区居民对社区事务冷淡，缺乏公共责任意识。 谈到民意采集情况，H社区负责消防安全的工作人员说：

1.2.4 茜素红染色 取各组细胞用PBS洗3遍后，用4%多聚甲醛固定30 min，吸去4%多聚甲醛溶液，加入3 mL茜素红染色液，室温染色30 min。蒸馏水速洗，在倒置显微镜下观察染色效果，拍照。

1.2.8 双荧光素酶基因检测 将细胞分为6组，分别为miR-26a mimic+空载体组、miR-26a mimic+CTGF 3'-UTR野生型、miR-26a mimic+CTGF 3'-UTR突变型、miR-26a inhibitor+空载体组、miR-26a inhibitor+CTGF3'-UTR野生型、miR-26a inhibitor+CTGF 3'-UTR突变型。将CTGF 3的3'-UTR序列克隆到荧光素酶载体中构建野生型或突变型质粒。将miR-26a与构建的质粒或相应对照共转染，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性检测，计算得出相对荧光素酶活性。

1.2.5 qPCR 检测miR-26a、CTGF 表达 Trizol 法提取RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。反应程序：95℃，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；72℃，25 s，循环40次。以2法计算相对表达量。引物序列如表（表1）。

2 结果

2.1 A7r5细胞钙化模型鉴定

Western blot和qPCR检测结果显示，与对照组比较，模型组细胞中miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（＜0.05），OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著升高（＜0.05）；与模型组相比，AR234960 干预后miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达无显著差异（＞0.05），而miR-26a mimic的干预后miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表达显著升高（＜0.05），OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著降低（＜0.05）。与miR-26a mimic组相比，AR234960+miRNA-26a mimic组miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（＜0.05），而OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白的表达显著升高（＜0.05，图6）。

2.2 VSMCs细胞钙化前后miR-26a、CTGF表达差异

随着VSMCs细胞钙化时间的增加，细胞中miR-26a的表达逐渐降低，且各个时间点与0 h相比均具有显著性差异（＜0.05，图2A）。CTGF mRNA的表达则与miR-26a 相反，随着钙化时间增加，细胞中CTGF mRNA 的表达逐渐增加（＜0.05），除12 h 时CTGF mRNA的表达与0 h之间没有显著差异（＞0.05），其他时间与0 h相比均具有统计学意义（＜0.05，图2B）。

2.3 转染效率鉴定

经过检测转染后细胞中miR-26a的表达量验证转染效率。由结果可知（图3），对照组、miR-26a-mimic NC、miR-26a-inhibitor NC 3组间没有显著性差异（＞0.05）。另外miR-26a-mimic组中miR-26a的表达量显著高于miR-26a mimic NC 组（＜0.05），而miR-26a-inhibitor组中miR-26a的表达显著低于miR-26a-inhibitor NC组（＜0.05）。说明miR-26a模拟剂和抑制剂转染成功。

2.4 各组细胞钙化沉积检测

与对照组相比，模型组ALP活性显著升高（＜0.05）；与模型组相比，AR234960干预后ALP的活性升高，但没有显著性差异（＞0.05），而miRNA-26a mimic显著降低了细胞中ALP 的活性（＜0.05）；与miRNA-26a mimic组相比，AR234960+miRNA-26a mimic组ALP活性显著升高（＜0.05，图5）。

2.5 ALP活性检测

茜素红染色结果（图4）显示，NC组中，细胞基质未着色，细胞无色。模型组中细胞外基质呈暗红色，可见明显钙化结节。与模型组组相比，AR234960增加了细胞的钙化程度，而miRNA-26a mimic则在一定程度上缓解了细胞钙化现象。

2.6 各组细胞中miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白表达情况

茜素红染色结果显示（图1），对细胞不做钙化处理时，细胞透明，细胞基质未着色。当钙化时间为12～24 h时，细胞基质钙盐沉积染色不明显，透明细胞较多。48～72 h细胞基质中有明显钙盐沉积，但72 h时钙化程度太为明显。为便于后续实验，选择48 h为钙化时间。

2.7 双荧光素酶报告基因检测

与miR-26a-mimic 组相比，miR-26a-inhibitor 组CTGF 3'-UTR 野生型中相对荧光素酶活性显著升高（＜0.05），而miR-26a-mimic组和miR-26a-inhibitor组在CTGF 3'-UTR突变型和空载组中均无显著性差异（＞0.05，图7）。

1.2.7 ALP 活性检测 收集各组细胞用PBS 冲洗3 次后，加入裂解液，冰上溶解30 min，收集细胞并用-70 ℃冰箱反复冻融3次，4 ℃，8000 r/min离心10 min，取上清，严格按照ALP活性检测试剂盒说明书检测ALP活性，实验重复3次。

3 讨论

近年来，许多研究表明miRNA在骨代谢和血管钙化中发挥着重要作用。OPG/RANKL/RANK信号通路是调节骨代谢的重要通路之一，而CTGF是一种由血管内皮细胞分泌的有丝分裂原，是RANKL的靶基因之一，其通过促进A7r5的生长、迁移、凋亡、粘附和基质成分的分泌，在动脉粥样硬化的发病机制中发挥重要作用。在本实验中钙化后细胞中CTGF基因的表达显著增加，同时miRNA-26a的表达显著降低。通过茜素红染色发现，CTGF激动剂AR234960能够诱导细胞钙化，而通过miRNA-26a干预后，细胞钙化现象得到缓解，表明miRNA-26a mimic能在一定程度上抑制细胞钙化。

2)中孔数量增加更有利N2和I-3吸附量(孔容)的增加。随硝酸改性时间、温度、浓度和超声功率增加，I-3的吸附量先增后减，在75 min、343 K、硝酸浓度为7 mol/L、功率为70～80 W时，改性活性碳I-3吸附最佳。

ALP、OPG、OPN、BMP-2是典型的骨钙化调节因子，但这些因子均已在血管中发现并且在病变血管与非病变血管之间存在差异。ALP作为一种催化磷酸单脂水解的金属酶，是钙化机制中最重要的功能基因之一。研究表明，钙化主动脉和主动脉瓣中ALP活性显著增加，而miRNA-29b处理的大鼠血清中ALP活性显著降低。在成骨细胞分化中高表达的矮小相关转录因子被敲除后，A7r5细胞中ALP的表达和钙化均显著降低。在本实验中，模型组细胞中ALP 的活性显著增加，AR234960 干预后使ALP 的活性增加加剧，而经过miRNA-26a mimic处理后，细胞中ALP活性均显著降低，表明miRNA-26a在一定程度上可以降低ALP的活性，缓解细胞钙化。

在实际问题中，团体可以是学校、医院、工厂、农庄等企事业单位，也可以是国家、北约、APEC等政治、军事、经济等组织.资源可以是活动空间或场所、交通工具、办公用具、通讯工具、医疗卫生健身娱乐以及生活用具等物品或准入票据(包括俱乐部的会员卡、影戏歌舞盛会的入场券、其他招待券通行证或门票)，也可以是各部门评优奖励或参与团体的会议、考察、旅游、宴会以及其他社交活动的限定名额(相当于席位问题的代表数).

BMP-2通过启动成骨基因的核心转录因子诱导间充质前体细胞向成骨细胞分化。Yang等研究表明，趋化因子分型素通过剂量依赖的方式促进OPN、BMP-2的表达，同时下调OPG的表达，进而对成骨钙化和动脉粥样硬化钙化起到促进作用。另有研究表明，OPG和核因子受体激活因子-κB配体细胞因子系统参与调节血管钙化，在血管中具有保护作用。在本实验中，A7r5细胞钙化后OPG的表达显著降低，Collagen II的表达显著增加。miRNA-26a mimic能够逆转细胞钙化导致的miRNA-26a 和OPG 表达降低，而OPN、BMP-2、Collagen II 的表达显著降低，为miRNA-26a mimic能够有效抑制血管钙化提供了新证据。通过双荧光素酶基因检测发现，miRNA-26a与CTGF之间存在靶基因结合位点。

综上，本实验表明miRNA-26a mimic 能够有效降低细胞中ALP活性及OPN、BMP-2、Collagen II基因的表达，同时增加钙化细胞中OPG基因水平。通过双荧光素酶基因检测证明了miRNA-26a与CTGF之间存在靶基因结合位点，为miRNA-26a通过调控CTGF水平进而对缓解血管钙化提供了理论依据。