毛细管区带电泳同时分离分析长春花中的4种生物碱

易 婷， 杨四梅， 黎升倩， 曹秋娥， 李 菲*

(云南大学化学科学与工程学院，云南昆明 650091)

长春花(Catharanthusroseus(L.)G.Don)为夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，在我国广东、广西、云南及海南等地广泛栽培。生物碱类是长春花的主要活性成分，对多种癌症有效，包括恶性淋巴瘤、横纹肌肉瘤、绒毛上皮癌和白血病等[1]。长春碱(Vinblastine，VLB)和长春新碱(Vincristine，VCR)是目前临床上常用的抗肿瘤药，VLB在霍奇金淋巴瘤治疗中占重要地位[2]，VCR用于白血病和淋巴癌等的治疗[3]。文多灵(Vindoline，VDL)和长春质碱(Catharanthine，CTR)是VLB和VCR的合成前体[4]，是著名的生物碱类降血脂药物[5]。因此，对长春花中这4种活性成分分离分析方法的研究具有重要意义。

目前，文献已报道的对长春花生物碱类成分的分离分析方法主要有：液相色谱-质谱法[6,7]、高效液相色谱法[8 - 11]、薄层扫描法和非水毛细管电泳法[12]，其中高效液相色谱法最为常见。毛细管电泳与高效液相色谱法相比，具有分析时间短、适用范围广且样品消耗量少等优势。目前用高效毛细管电泳同时分离分析长春花中的长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的相关研究还未见报道。本研究采用毛细管区带电泳法，建立了一种14 min内同时分离检测长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的新方法，可用于长春花药材中4个目标组分的同时检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACETMMDQ型毛细管电泳仪(美国，Sciex)；未涂层石英毛细管(70 cm×75 μm i.d.，有效长度50 cm)(河北省永年锐沣色谱器件有限公司)；ST2100型pH计(奥豪斯仪器有限公司)。

长春碱、长春新碱、长春质碱、文多灵标准品(中国药品生物制品鉴定所)，用甲醇作溶剂，配制浓度为1.0 mg/mL的长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的标准储备溶液，于4 ℃冰箱保存；紫红色的长春花茎叶和花瓣，红色和白色的长春花茎叶药材，经云南大学生科院陆树刚鉴定为夹竹桃科长春花属(Catharanthus)植物的干燥茎叶和花瓣。实验用试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 样品溶液的制备

分别准确称取1.0000 g完全干燥后的紫红色长春花茎叶和花瓣、红色和白色的长春花茎叶，置于250 mL锥形瓶中，加入15 mL饱和Ca(OH)2溶液和35 mL甲醇，超声提取60 min，过滤后减压蒸馏除去溶剂，用甲醇溶解定容至10 mL，于4 ℃冰箱保存。所有溶液经0.45 μm滤膜过滤使用。

1.3 实验方法

以H3PO4-NaH2PO4(NaH2PO4浓度为39 mmol/L，pH=4.31)为运行缓冲溶液，加入2.0%的正丁醇和10%的乙腈添加剂。仪器条件：分离电压20 kV，进样5 s(压力3447.38 Pa)，柱温25 ℃和波长214 nm。

仪器开机和两次运行间，依次用0.1 mol/L NaOH、纯水和运行缓冲溶液冲洗3、3、5 min。

2 结果与讨论

2.1 运行缓冲溶液的pH值对分离的影响

长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵结构中的氮原子，在酸性条件下可发生质子化。因此，实验采用磷酸盐为背景电解质，在酸性介质(pH=3.40～4.49)中研究了pH值对分离的影响。见图1，pH增大，迁移时间减短，但分离度下降。为了保证分离度，同时缩短分离时间，实验选择以pH=4.31的H3PO4-NaH2PO4溶液(NaH2PO4浓度为39 mmol/L)作为运行缓冲溶液。

图1 pH值对4种生物碱迁移时间的影响Fig.1 Effect of pH on migration time of four alkaloids

2.2 正丁醇浓度对分离的影响

为增大分离度和改善峰形，在上述运行电解质溶液(pH=4.31)中添加正丁醇，有机溶剂的加入，可以增加样品溶解性使其形成均一溶液，同时降低电渗流，改善分离。实验研究了正丁醇(体积分数于0.2%～2.4%之间)对分离度的改善情况(图2)。结果表明，随浓度增加，迁移时间延长，长春碱和长春新碱间分离度有所改善。当正丁醇为2.0%时，4种组分间分离度和峰形较好。因此，实验选择在缓冲体系中添加体积分数为2.0%的正丁醇。

图2 正丁醇体积分数对4种生物碱迁移时间的影响Fig.2 Effect of n-butanol volume fraction on migration time of four alkaloids

2.3 乙腈浓度对分离的影响

为改善基线噪音，增大分离度，研究了加入不同浓度乙腈对各组分分离的影响。如图3，增大乙腈浓度，基线平稳，乙腈为10%时，各组分间分离度最佳，且峰形尖锐，基线良好。但当乙腈浓度大于10%时，长春碱和长春新碱的分离度下降，甚至出现重叠。因此，实验选择10%乙腈。

图3 乙腈体积分数对4种生物碱迁移时间的影响Fig.3 Effect of acetonitrile volume fraction on migration time of four alkaloids

2.4 仪器条件的优化

实验考察了分离电压和进样时间对分离的影响。研究发现，在18～25 kV范围内，随分离电压增大，峰形尖锐，分离度下降；进样时间在3～9 s内，随时间延长，峰形展宽，且分离度下降。综合考虑，确定分离电压20 kV，3.447 kPa进样5 s。

优化条件下14 min内长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵实现基线分离，且峰形较好，见图4。具有代表性的紫红色长春花茎叶样品的电泳图如图5。

图4 优化电泳条件下4种标准品混合溶液的电泳图Fig.4 Electropherogram of mixed solution of four standards under optimized electrophoresis conditions1.vinblastine;2.vincristine;3.catharanthine;4.vindoline.

图5 紫红色长春花茎叶样品的电泳图Fig.5 Electropherogram of purplish red leaves and stems of Catharanthus roseus1.vinblastine;2.vincristine;3.catharanthine;4.vindoline.

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系验证将标准储备液稀释得到不同浓度的标准品混合溶液进行电泳分析。以各组分的峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标绘制工作曲线，结果见表1。配制5份质量浓度均为100 μg/mL的标准品混合溶液进行测定，由表1可知，各组分峰面积与迁移时间的相对标准偏差(RSD)均小于2%。

表1 待测组分的工作曲线和重复性验证结果

2.5.2 中间精密度同一人员连续2 d分别进样5次测定，标准品混合溶液的峰面积和保留时间RSD值均小于3.0%。不同分析人员，分别进样5次测定，所得结果的峰面积和保留时间RSD值均小于4.0%。

2.5.3 稳定性取同一样品溶液，分别在室温放置0、2、4、6、8、16 h后，测定长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的含量，各组分含量的RSD值均小于4.3%，说明该方法有较好的稳定性。

2.5.4 准确度通过测定长春花药材的加标回收率验证方法的准确度，各组分的加标回收率都在93.7%～108.9%之间，RSD值均不大于4.1%，由此证明该方法准确度符合要求。

2.6 样品分析

将上述毛细管区带电泳新方法用于分离测定4种样品溶液中的4种目标组分，结果见表2。可见，4种长春花药材中各目标组分的质量浓度有显著差异，其中紫色花瓣样品中目标成分含量少，红色和白色的长春花茎叶样品中目标成分含量相对较高。表中各组分含量的RSD值均小于4.0%，说明测定结果准确，该方法可行，具有一定的实用价值。

表2 样品中4种生物碱的含量(n=3)

3 结论

采用毛细管区带电泳法，建立了一种可在14 min内同时分离检测长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的新方法。该方法可实现4种目标成分的基线分离与准确检测，具有较高的实用价值。