增强型绿色荧光蛋白标记膀胱癌外泌体的构建及其体外示踪作用

陈辉 侯爱华 王培培 梅晓峰

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症发病率中排第十[1]。外泌体是直径约40～160 nm 的细胞外囊泡，起源于细胞内吞作用形成的早期内体，而后在其他细胞内囊泡和细胞器的相互作用下被释放到细胞外环境中[2]。外泌体的膜结构为磷脂双分子层，膜上含有多种蛋白质和脂质，外泌体内部也含有多种生物活性分子，如RNA、脂质和蛋白质等[3－4]。细胞通过外泌体在细胞间传递生物活性分子，进行信息交流[5]。已有研究表明，外泌体与膀胱癌的发生发展、侵袭转移、诊断和治疗密切相关[6]。

为了明确外泌体的体内外分布状况，现已开发出多种标记物用于外泌体的示踪，目前外泌体的标记物主要有荧光染料、荧光蛋白、荧光素酶和无机荧光纳米材料等。荧光染料是目前最常用的外泌体示踪标记方法，其中亲脂性染料（如DiR、DiI、PKH26、PKH67 等）是使用最多的标记方法。虽然该方法操作简单，但限于目前的提取方法，外泌体中会有脂蛋白杂质的存在，亲脂性染料标记外泌体的同时也会与脂蛋白结合；另外，亲脂性染料标记外泌体后，无法将未结合的亲脂性染料与外泌体完全分开，使外泌体的示踪产生假阳性结果[7-9]。无机荧光纳米材料标记外泌体具有高灵敏度和高时空分辨率的特点，但是需要特定的昂贵的仪器才能检测，如正电子发射断层扫描仪、全自动γ 计数仪等[10]。由于荧光染料在标记外泌体的过程中会对实验结果造成干扰，且无机荧光纳米材料的检测仪器不具有通用性，因此本研究选择荧光蛋白进行外泌体的示踪。

人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要包括70%～90%淋巴细胞、10%～30%单核细胞和1%～2%树突细胞。膀胱癌组织微环境中存在多种免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、CD8+T 细胞、调节性T 细胞、树突细胞、髓源性抑制细胞等[11]。邵剑锋等[12]发现，膀胱癌组织微环境中CD163+/CD206+单核巨噬细胞异常增高，且该群细胞与肿瘤进展密切相关。Chen 等[13]发现，单核细胞在膀胱癌组织区域可进行M2 极化并分化。目前，膀胱癌生物学行为与免疫细胞之间的关系尚未明确，本研究初步探讨了膀胱癌外泌体与PBMC 之间的联系。

本研究通过将CD63 基因插入到pLVX-EGFPpuro 慢病毒载体中，构建出表达CD63-EGFP 融合蛋白的pLVX-CD63-EGFP 重组质粒，将重组质粒转染到293T 细胞中，得到CD63-EGFP 慢病毒，用CD63-EGFP 慢病毒侵染膀胱癌5637 细胞，筛选出稳定表达CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌细胞株，提取其外泌体进行鉴定，最后将EGFP 标记的膀胱癌外泌体或膀胱癌细胞与人正常膀胱上皮细胞SVHUC-1 和PBMC 共培养，探讨SV-HUC-1 和PBMC对膀胱癌外泌体的摄取情况。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI-1640 培养基、DMEM 培养基、胰蛋白酶、青链霉素、嘌呤霉素、Ficoll 分离液和Transwell 小室（北京索莱宝科技有限公司），FBS（Biological Industries 公司，以色列），无外泌体FBS（SBI 公司，美国），TRIzol 裂解液（Life Technologies 公司，德国），逆转录试剂盒（Thermo Fisher 公司，德国），DNA 聚合酶、EcoR Ⅰ酶、Xho Ⅰ酶、T4 DNA 连接酶（TaKaRa公司，日本），PEI 和聚凝胺（Sigma 公司，美国）。

兔抗人CD63 抗体、兔抗人HSP70 抗体和兔抗人Lamin B1 抗体（Abcam 公司，英国），山羊抗兔抗体（Proteintech 公司，美国）。pLVX-EGFP-puro、psPAX2、pMD2.G、293T 细胞系、5637 细胞系和SVHUC-1 细胞系由梅晓峰教授惠赠。PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。CD63 上游引物：CGCGAATTCATGGCGGTGGAAGGAGGAATG；下游引物：CGCCTCGAGGCATCACCTCGTAGCCACTTC。

1.2 方法

1.2.1 构建pLVX-CD63-EGFP 重组质粒

体外培养5637 细胞，用TRIzol 裂解液提取细胞RNA，逆转录得到cDNA，逆转录体系：5× Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAid RT（200 U/μL）1 μL，Oligo（dT）18 primer 1 μL，RNA 1 μg，加无核酸酶水至20 μL；反应条件：42 ℃60 min，70 ℃5 min，1 个循环。以cDNA 为模板，PCR 反应扩增CD63，PCR 反应体系：5× PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，CD63-F（10 μmol/L）1 μL，CD63-R（10 μmol/L）1 μL，CD63 50 ng，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，加无核酸酶水至50 μL；反应条件：98 ℃1 min，1 个循 环，98 ℃10 s，55 ℃15 s，68 ℃1 min，30 个 循环，胶回收CD63 DNA。用EcoR Ⅰ酶和Xho Ⅰ酶酶切CD63 DNA 和质粒pLVX-EGFP-puro，胶回收酶切片段。用DNA 连接酶将CD63 酶切片段连入质粒pLVX-EGFP-puro 中得到pLVX-CD63-EGFP 重组质粒，连接条件：25 ℃，2 h。将重组质粒转化入DH5α 感受态细菌中，转化条件：42 ℃，90 s。通过含100 μg/mL Amp 的LB 平板筛选出阳性菌落，挑取单个菌落摇菌提取质粒，进行Xho Ⅰ酶和EcoR Ⅰ酶双酶切鉴定，并由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，得到pLVX-CD63-EGFP 重组质粒。

1.2.2 细胞转染

将293T 细胞按3×105个/孔的密度接种到6 孔板中，24 h 后更换为2 mL DMEM 基础培养基；取两个EP 管，加入250 mL Opti-MEM 培养基，一个加入4 μg 混合质粒（pLVX-CD63-EGFP:psPAX2:pMD2.G=4:3:2），另一个加入12 μg PEI，静置10 min；将含有PEI 的Opti-MEM 培养基加到含有混合质粒的培养基中，静置20 min；把质粒-PEI 混合物加到细胞培养基上清中；8 h 后更换为2 mL DMEM 完全培养基；48 h 后收集上清，500×g 离心5 min，用0.45 μm过滤器过滤上清，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 慢病毒侵染膀胱癌细胞

将5637 细胞按3×105个/孔接种到6 孔板中，24 h 后更换为1 mL 含8 μg/mL 聚凝胺的RPMI-1640 完全培养基，加入1 mL 病毒上清液；24 h 后更换为2 mL RPMI-1640 完全培养基；48 h 后，用含2 μg/mL 嘌呤霉素的RPMI-1640 完全培养基筛选表达CD63-EGFP 融合蛋白的5637 细胞。

1.2.4 超速离心法提取外泌体

用不含外泌体的RPMI-1640 完全培养基培养5637 细胞，收集上清；4 ℃，300×g 离心10 min，收集上清；4 ℃，2 000×g 离心10 min，收集上清；4 ℃，10 000×g 离心30 min，收集上清；4 ℃，100 000×g 离心70 min，弃上清；加入PBS 重悬沉淀，再次4 ℃，100 000×g 离心70 min，弃上清，收集沉淀，加入100 μL PBS 重悬，放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.5 外泌体的鉴定

1.2.5.1 透射电子显微镜观察外泌体的形态

将15 μL 外泌体样本加在铜载网表面，静置150 s；滴加15 μL 3%醋酸双氧铀溶液在铜载网表面，染色3 min，用滤纸吸去上层多余液体；滴加30 μL超纯水在铜载网上洗去多余的醋酸双氧铀，用滤纸吸去上层多余液体；室温干燥2 h 后拍照。

1.2.5.2 粒径分析

用PBS 将15 μL 外泌体样本稀释为1 mL，震荡混匀，缓慢注入到样品池中，测定外泌体的粒径大小。

1.2.5.3 Western blot 检测外泌体的标志蛋白

将5637 细胞在含1 mmol/L PMSF 和1%蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液中冰上裂解30 min，裂解液4 ℃，5 000×g 离心15 min，取上清。用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将外泌体和细胞裂解液在100 ℃下煮沸10 min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并将蛋白转移到PVDF 膜上，PVDF 膜在BSA 封闭液中封闭2 h，与相应的抗体4 ℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗室温下孵育2 h。使用以下抗体：抗CD63（1:1 000）、抗HSP70（1:1 000）、抗Lamin B1（1:1 000）、山羊抗兔IgG 抗体（1:5 000）。最后，将PVDF 膜用标准ECL 试剂处理检测。

1.2.6 EGFP 标记的膀胱癌外泌体与SV-HUC-1 共培养

把盖玻片放入6 孔板中，将SV-HUC-1 按照2×106个/孔的密度接种到板中，培养8 h 后向培养基中加入EGFP 标记的膀胱癌外泌体；继续培养24 h 后，弃上清，PBS 清洗细胞3 次；加入4%多聚甲醛固定细胞，静置20 min，PBS 清洗细胞3 次；加入200 μL 0.1 μg/mL DAPI 染料，静置5 min，PBS 清洗细胞3 次；室温避光静置15 min 后，用共聚焦显微镜观察。

1.2.7 表达CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌细胞与PBMC 共培养

使用Ficoll 分离液从健康人的外周血中提取PBMC，按2×105个/孔的密度接种到6 孔板中，同时将表达CD63-EGFP 融合蛋白的5637 细胞按2×105个/孔接种到0.4 μm 孔径的Transwell 小室中，再把Transwell 小室放入6 孔板中共培养，将未作处理的PBMC 设为对照组，24 h 后用BD FACSCantoTM Ⅱ流式细胞仪检测PBMC。

2 结果

2.1 pLVX-CD63-EGFP 重组质粒的构建

将CD63 基因插入到pLVX-EGFP-puro，得到pLVX-CD63-EGFP 重组质粒，重组质粒图谱如图1A 所示。pLVX-CD63-EGFP 重组质粒经过EcoRⅠ酶和Xho Ⅰ酶酶切后，得到两个片段，分别与CD63 基因和pLVX-EGFP-puro 质粒的碱基数一致（图1B）。pLVX-CD63-EGFP 重组质粒基因测序结果与CD63 基因序列完全匹配，无基因突变。

图1 pLVX-CD63-EGFP 重组质粒的鉴定Fig.1 Identification of pLVX-CD63-EGFP recombinant plasmid

2.2 表达CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌细胞株的构建

通过PEI 将pLVX-CD63-EGFP 重组质粒转染到293T 细胞中，获得CD63-EGFP 慢病毒，侵染5637 细胞后，用嘌呤霉素筛选出表达CD63-EGFP融合蛋白的细胞株，在细胞膜上观察到绿色荧光信号（图2、3）。

图2 表达CD63-EGFP 融合蛋白的5637 细胞Fig.2 5637 cells expressing CD63-EGFP fusion protein

2.3 外泌体的鉴定

通过超速离心法提取外泌体，透射电子显微镜下观察到外泌体呈杯口状（图3A）。粒径分析显示，外泌体直径40～120 nm（图3B）。Western blot 结果显示，外泌体中表达有四跨膜蛋白CD63 和热休克蛋白HSP70，不表达细胞核中特有的核纤层蛋白Lamin B1（图3C）。

图3 EGFP 标记的膀胱癌外泌体的鉴定Fig.3 Identification of EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.4 SV-HUC-1 可在体外摄取膀胱癌外泌体

将EGFP 标记的膀胱癌外泌体加入SV-HUC-1的培养基中，与SV-HUC-1 共培养后，可在SVHUC-1 中观察到大量绿色荧光信号，分布于细胞质中（图4）。

图4 与EGFP 标记的膀胱癌外泌体共培养后的SV-HUC-1Fig.4 SV-HUC-1 cells co-cultured with EGFP-labeled bladder cancer exosomes

2.5 PBMC 中的单核细胞可在体外摄取膀胱癌细胞外泌体

将表达CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌细胞与PBMC 通过Transwell 小室共培养后，可在PBMC 中检测到15.4%的单核细胞携带有绿色荧光信号，而对照组中没有细胞携带有绿色荧光信号（图5）。

图5 单核细胞体外摄取膀胱癌细胞外泌体Fig.5 In vitro uptake of exosomes from bladder cancer cells by monocytes

3 讨论

外泌体是细胞分泌到细胞外环境的囊泡，通过传递生物活性分子介导细胞间的信息交流，在多种生理病理活动中发挥作用，包括免疫反应、肿瘤进展等[14]。但由于外泌体属于纳米级囊泡，未明确外泌体的体内外生物学功能，常需要进行荧光标记示踪。本研究通过外泌体标志蛋白CD63 与EGFP 的融合蛋白来标记膀胱癌外泌体，避免了使用荧光染料可能出现的假阳性结果，同时使用常规实验设备即可检测，为研究膀胱癌外泌体的体内外分布情况奠定了基础。

肿瘤微环境在癌症的发生发展和转移中发挥着重要的作用，而膀胱癌对多种肿瘤微环境相关细胞造成影响，导致膀胱癌的进展。Lin 等[15]证明，膀胱癌细胞通过外泌体将miRNA-21 传递给巨噬细胞，使巨噬细胞极化为M2 表型，促进膀胱癌的侵袭迁移能力。Ringuette 等[16]发现，膀胱癌能通过外泌体将转化生长因子-β 传递给成纤维细胞，激活SMAD 通路，使成纤维细胞转化为癌相关成纤维细胞。本研究通过EGFP 标记的膀胱癌外泌体与SVHUC-1 共培养，发现SV-HUC-1 能在体外摄取膀胱癌外泌体，证明EGFP 标记的外泌体可用于体外示踪。

另外，Ying 等[17]证明了外泌体可以从Transwell小室的上室到达下室并影响下室细胞的功能。Gao等[18]通过Transwell 共培养系统发现了成熟树突细胞外泌体可促进内皮的炎症。因此，本研究使用Transwell 小室将表达CD63-EGFP 融合蛋白的膀胱癌细胞与PBMC 共培养，发现PBMC 中的单核细胞可在体外摄取膀胱癌细胞外泌体，证明了用融合蛋白标记外泌体的方法可以省去外泌体的提取过程，直接通过细胞共培养的方式进行外泌体的体外示踪研究，而且可以通过流式细胞技术对细胞摄取外泌体的情况进行分析，而膀胱癌外泌体对SVHUC-1 和单核细胞的生物学功能的影响尚需进一步研究。