白粉病菌对结果期南瓜叶片光合特性和叶绿体超微结构的影响

叶佳净，赵锦鹏，卞世杰，郭卫丽，李新峥

（河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡 453003）

南瓜属主要栽培种中国南瓜（CucurbitamoschataDuchesne，俗称倭瓜、番瓜）、印度南瓜（Cucurbita maximaDuchesne，俗称笋瓜）和美洲南瓜（Cucurbita pepoL.俗称西葫芦），在世界范围广泛栽培，具有重要的经济价值[1]。白粉病是普遍发生且严重危害南瓜生产的一种真菌性病害，其发病率高、发病面积大、传播速度快，在黑龙江、河南、甘肃以及陕西关中等地区发生日趋严重，成为限制南瓜生产的重要因素[2-4]。南瓜白粉病主要侵染叶片，发病初期叶面出现白色小斑点，随后扩散至整个叶片，表现为覆盖白色粉状物；发病后期白粉病斑由白色变为黄褐色，有分生孢子闭囊壳产生，叶片发黄严重甚至焦枯，严重影响植株正常光合作用，降低南瓜的产量与品质[5]。

病原菌侵染时，植物光合效率降低，通常与光合器官受损、光合代谢所需激发能过量增加有关，最终导致氧气的下降和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生[6-8]。过量ROS积累间接诱导植物的过敏性反应（Hypersensitive reaction，HR）[9]。HR是植物与病原菌不亲和互作发生的一种抗病反应，表现为在病原菌侵染处形成不同于周围健康组织的局部细胞坏死斑[10]，是细胞程序性死亡的主要形式，可以激发邻近组织的防卫反应和植株的系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）[11]。甜瓜幼苗感染白粉病后光合指标下降，包括净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）[12]。张兆辉等[13]研究发现，接种白粉病菌的西葫芦叶片叶绿体结构发生类囊体膨大、基质片层和基粒片层扭曲等变化。白粉病降低植物的光合作用，但关于白粉病菌如何影响南瓜光合特性的机制报道很少。鉴于南瓜果实发育期开花和幼果生长阶段易暴发白粉病，以白粉病不同抗性南瓜品种为试材，研究白粉病菌对南瓜结果期叶片光合指标、细胞坏死及叶绿体超微结构的影响，分析其光合特性变化的生理机制，以期丰富南瓜抗白粉病的机制研究理论。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试南瓜材料为中国南瓜品种九江轿顶（JJJD）和自交系112-2，其中JJJD 高感白粉病，112-2 高抗白粉病。2001 年至今，在实验室人工接种白粉病菌，自交系112-2 幼苗期植株均表现出稳定的高抗白粉病特性[14-15]。在田间自然发病条件下，南瓜结果期自交系112-2 整株基本未出现白粉症状，而相邻定植的JJJD 中下部叶片布满大小不一的白粉斑，发病严重的基部叶片出现萎黄、早衰症状，并向上蔓延。112-2和JJJD 种子均由河南科技学院南瓜课题组提供。

1.2 试验设计

2020 年4 月在河南科技学院育种实验室将供试南瓜种子浸种催芽后播种于穴盘内，幼苗长至两叶一心时移栽到口径为30 cm 的大盆中，将大盆搬至室外进行盆栽管理，植株进入结果期即第1 朵雌花开花后，进行白粉病菌接菌处理。采集感白粉病的南瓜叶片[白粉病菌为单囊壳属白粉菌（Podosphaera xanthii）]，用软毛刷将白粉病菌孢子扫入培养皿内，无菌水稀释，调整孢子悬浮液终浓度为1×105个/mL。采用喷雾法将白粉病菌孢子悬浮液喷洒于结果期南瓜第1 朵雌花上下的2 片叶片，以叶片布满雾滴状水珠但不滴落为宜，CK 喷清水（不接种白粉病菌）。以112-2-PM、JJJD-PM 分别表示112-2、JJJD 接种白粉病菌处理，112-2-CK、JJJD-CK分别表示112-2、JJJD清水对照处理。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 光合参数测定 自然光照条件下，随机选取清水（CK）和白粉病菌处理的结果期南瓜植株各9株，每株选择雌花附近、长势一致的2 片叶片做标记，于9:00—11:00 间用Li-6400 便携式光合仪测定南瓜叶片的Pn、Gs、Tr和Ci，从接种白粉病菌当天开始，间隔1 d 测1 次，至接种后第12 天结束，即0、2、4、6、8、10、12 d。每个叶片重复测定3次。

1.3.2 坏死斑观察 分别在接种白粉病菌后0、4、5、6 d 随机选取2 种南瓜材料各12 株，每株选择雌花附近、长势一致的叶片，避开叶脉，剪取叶片样本大小1 cm×1 cm，设置3个重复。将剪取的南瓜叶片浸没在台盼蓝染色液中，沸水浴2 min 后，乙醇脱色至透明。将脱色后的叶片制成玻片，在倒置荧光显微镜下观察，细胞坏死斑被台盼蓝染色剂染成蓝色。每个样品取10个视野。

1.3.3 叶绿素含量测定 参照蔡庆生[16]的方法。分别于接种白粉病菌后0、4、8、12 d随机选取2种结果期南瓜植株各12 株，每株选择雌花附近、长势一致的叶片，避开叶脉剪碎混匀，称取0.2 g放于研钵中，倒入95%乙醇及少量碳酸钙，研磨成匀浆，静置3～5 min 后过滤，95%乙醇定容至25 mL，摇匀，设置3次重复。测定叶绿素a（Ca）含量、叶绿素b（Cb）含量以及总叶绿素（CT）含量。

Ca（mg/g）=13.95A665-6.88A649，

Cb（mg/g）=24.96A649-7.32A665，

CT（mg/g）=6.63A665+18.08A649。

1.3.4 叶绿体超微结构观察 接种白粉病菌后4 d，选取112-2 和JJJD 南瓜各3 株，取上述相同叶位的叶片，以健康无病害的叶片作CK。用锋利徕卡刀片避开主叶脉切取0.5 mm×1.0 mm 的小块，快速投入装有预冷戊二醛（4%）溶液的青霉素小瓶中，用注射器抽气至材料大部分下沉于瓶底部，4 ℃下固定6 h；用磷酸缓冲液（0.1 mol/L）冲洗3 次，每次30 min；四氧化饿固定液二次固定6 h，磷酸缓冲液再次冲洗；用不同体积分数的（15%、30%、50%、70%、80%、90%、100%）乙醇连续脱水2 次，每次30 min；丙酮过渡，环氧树脂渗透包埋，在35 ℃12 h、45 ℃12 h、60 ℃24 h 条件下分别聚合；用LEICA EM UC7 型超薄切片机钻石刀切片，切片厚60～80 nm，25 ℃下用醋酸双氧铀-柠檬酸铅进行双重染色。于HITACHI-HT7700 型透射电子显微镜下观察拍照，每个样品取10个视野。

1.4 数据处理与分析

所有数据均取3 次重复的平均值，数据分析和作图分别用SPSS 2.0软件和Excel 2003进行。

2 结果与分析

2.1 白粉病菌对南瓜结果期叶片光合指标的影响

图1 显示，接种白粉病菌后，2 种材料（112-2 和JJJD）叶片的Pn、Tr 和Gs 均低于清水对照，JJJD 的Pn 下降幅度总体上大于112-2，其中，112-2 和JJJD叶片Pn 在接种后2 d 分别比相应对照降低45.4%和63.8%；但接种后6～10 d，2 种材料叶片的Ci 则高于对照。抗性材料112-2 接菌后总体上表现为Pn 高于感病材料JJJD 接菌处理，Ci低于感病材料JJJD 接菌处理。可见，白粉病会影响结果期南瓜叶片的光合效率，降低Pn、Tr 和Gs，增加Ci，说明白粉病菌侵染降低了叶片对Ci 的利用率，此外，感病材料中这种影响高于抗病材料。

图1 白粉病菌对南瓜材料112-2和JJJD结果期叶片光合指标的影响Fig.1 Effect of powdery mildew pathogens on photosynthetic indexes of leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.2 白粉病菌对南瓜结果期叶片叶绿素含量的影响

图2显示，与CK 相比，接种白粉病菌后，JJJD 的Ca、Cb 和CT 含量在接菌前期（接种后0～8 d）无明显变化，而在接种后第12天明显降低，与CK相比分别降低50.0%、47.0%和49.0%；材料112-2 Ca、Cb 和CT含量在接种后4 d和12 d明显低于CK，其中接种后12 d 分别下降65.0%、54.0%和57.0%，降幅明显高于感病材料JJJD。表明白粉病菌侵染降低了南瓜结果期叶片Ca、Cb 和CT 的含量，其中Ca 含量下降最多，且抗病材料叶绿素含量的下降幅度较大。

图2 白粉病菌对南瓜材料112-2和JJJD结果期叶片叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of powdery mildew pathogens on chlorophyll content in leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.3 白粉病菌对南瓜结果期叶片细胞坏死的影响

图3 显示，接种白粉病菌后4 d，112-2 和JJJD均出现坏死斑，随着接种后时间的延长，坏死斑面积增大、颜色加深，感病材料JJJD 坏死斑面积明显大于抗病材料112-2 且颜色较深，表明接种白粉病菌诱发结果期南瓜叶片出现HR，感病材料HR 发生较严重。

图3 结果期南瓜接种白粉病菌后叶片细胞坏死的观察Fig.3 Observation of cell necrosis in powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

2.4 白粉病菌对南瓜结果期叶片叶绿体超微结构的影响

图4 显示，清水处理南瓜材料（112-2 和JJJD）叶绿体呈现长椭圆形，紧靠细胞膜分布，叶绿体膜结构清晰平滑，基质片层和基粒片层排列紧密，片层垛叠整齐均匀，有少量电子密度高的嗜锇体存在。接种白粉病菌后4 d，112-2 叶片叶绿体大多肿胀变形，并向细胞中央游离，基质片层排列疏松，基粒片层不规则排列，嗜锇体增多，积累较多的淀粉粒；JJJD 叶片叶绿体的肿胀程度大于112-2，叶绿体间挤压严重，细胞膜、基质片层、基粒片层模糊不清，淀粉粒较多，并形成大量油滴。

图4 结果期南瓜接种白粉病菌后叶绿体超微结构的观察Fig.4 Chloroplast ultrastructure observasion of powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

3 结论与讨论

植物叶片光合系统对白粉病非常敏感。金海军等[17]研究表明，在感染白粉病菌的17 份黄瓜材料中大多数材料Pn、Tr、Gs明显降低，Ci增加。本研究也表明，结果期接种白粉病菌的南瓜叶片Pn、Tr、Gs均降低，而Ci 增加。通常，气孔关闭和叶肉细胞光合活性下降导致的非气孔因素是病原菌胁迫引起植物光合作用下降的主要影响因素。FARQUHAR等[18]研究表明，Gs 下降，Ci 不变或上升，光合速率下降是由叶肉细胞同化能力降低等非气孔因素引起的。本试验结果显示，结果期接种白粉病菌后，南瓜叶片的Gs 下降，Ci 上升，说明非气孔因素是南瓜叶片光合作用降低的主要原因之一，这与李宁等[19]和王莹等[20]的研究结果一致。

植物的光合作用受过敏反应抑制，光合作用受抑制又会导致ROS 产生[21]，ROS 影响叶绿体PSⅡ的活性，被侵染的细胞由于PSⅡ活性丧失，干扰了细胞存活所必需的动态平衡，反过来加速了过敏反应[22]。本试验中，接种白粉病菌后4 d，南瓜（112-2和JJJD）叶片均出现明显的过敏反应，随着接种后时间的延长，感病材料JJJD 细胞坏死斑面积扩展更大，进一步限制了叶片的光合速率，说明过敏反应与南瓜材料的抗/感病性有关，在抗性材料112-2 上白粉病菌的生长受到有效抑制[13]。

病原菌侵染植物后可破坏叶绿体的结构和功能，使叶绿素含量下降。甜瓜感染白粉病后叶绿素含量下降[23]。本试验发现，接种白粉病菌后，南瓜材料Ca、Cb 和CT 含量均明显下降，且抗性材料112-2叶绿素含量的下降幅度较大，与柯思佳等[24]研究认为抗性甜瓜材料能减缓蔓枯病对叶绿素含量的影响不同，这可能与试验品种或测定时间不同有关。叶绿体是植物光合反应的主要场所，其结构的稳定与否直接影响光合作用的强弱[25]，甘薯感染疮痂病后叶绿素被降解，叶绿体超微结构发生变化，叶绿体膜流动性降低，感病品种叶绿体受损程度远大于抗病品种[26]。本试验发现，南瓜感染白粉病菌后叶绿体肿胀变形，基质片层排列疏松，基粒片层不规则排列，嗜锇体和淀粉粒增多，且感病材料叶绿体结构受损更为严重。病原菌侵染导致植株产生大量ROS，引起叶绿体膜过氧化[27]，造成叶绿素降解，致使植物光合能力下降。ROS 对膜系统的损伤进一步阻碍了淀粉的水解和向外运输，导致叶绿体中大量淀粉粒累积，淀粉的这种积累称为被动存储[28]。大量淀粉颗粒的产生挤压叶绿体，使叶绿体肿胀加剧，南瓜接种白粉病菌后叶绿体中嗜锇体数量增多反映叶绿体膜受到了过氧化损伤，感病材料JJJD 叶绿体中出现大量油滴表明叶绿体膜过氧化程度加深，对叶绿体结构造成了不可逆的损伤。总之，结果期白粉病菌侵染引起南瓜叶片光合性能下降，主要归因于侵染点细胞坏死、叶绿素含量下降和叶绿体结构受到破坏，抗病材料112-2 光合速率降幅较小与细胞坏死和叶绿体结构受损程度较轻有关。