瘤胃源枯草芽孢杆菌BX1-12的筛选鉴定及其产酶抑菌活性

孙尹双，陈甜甜，白冬红，辛国芹，汪祥燕，徐海燕，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室，山东泰安 271000）

抗生素长期、大量使用，其弊端日益凸显，例如：病原菌耐药性的产生、畜禽肠道微生态紊乱及免疫力下降、抗生素残留等，严重制约畜牧业的持续、健康发展，很多国家已经明确禁止使用饲用抗生素（窦茂鑫等，2013）。因此，寻找安全、有效的新型绿色饲料添加剂迫在眉睫。饲用微生态制剂作为饲料添加剂，一方面能够通过产生复合酶系分解糖类、蛋白质、纤维素等物质，从而提高饲料利用率，同时还能维持动物肠道微生态的稳态，抑制病原菌的生长与繁殖，提升动物的免疫力等（Abd等，2020）。有研究表明，在日粮中添加微生态制剂不仅能够提升猪的免疫力、生长性能，还能够减少有害气体的排放（Lei等，2014）。随着研究的不断深入，以有益微生物开发的动物微生态制剂已被养殖产业接受并广泛使用（张增卫，2013）。

动物微生态制剂开发的核心是优良菌种的选育。理想的生产菌种应具备以下几个特点：（1）安全性好，对宿主、环境无害；（2）能够在消化道、肠道定植；（3）功能明确，能够产生有益物质，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等；（4）能够抑制病原菌；（5）稳定性好，加工及贮存过程中能够保持活性（赵述淼，2009）。目前用于开发动物微生态制剂的菌种主要是芽孢杆菌（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacillus）等。与其他类型的益生菌相比，芽孢杆菌由于其功能突出、抗逆性强、生产及贮藏性能好而具有广阔的开发及应用前景（张新雄等，2013）。本研究以健康高产奶牛瘤胃液为筛选源，旨在筛选出产酶性能和抑菌性能优良的菌株，为饲用芽孢杆菌奶牛微生态制剂的研究和开发提供科学依据和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液的采集 于晨饲前从健康高产奶牛采集瘤胃液，通过4层纱布过滤，置于39℃保温瓶中，立即盖严瓶口并转移至实验室保温存放。

1.1.2 培养基NA（Nutrient Agar）固体培养基：蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%～2%，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，酵母膏0.5%，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。大豆胰蛋白胨琼脂培养基（TSA）：胰蛋白胨1.5%，大豆胨0.5%，氯化钠0.5%，琼脂1.3%，pH 7.3～7.5。

1.1.3 供试病原菌 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和伤寒沙门氏菌（Salmonella trphimurium）均由山东省动物微生态制剂重点实验室保藏并提供。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液中芽孢杆菌的分离 将新鲜瘤胃液取出后充分混匀，吸取10 mL置于装有90 mL无菌水的锥形瓶中，80℃水浴15 min杀灭非芽孢菌；按照梯度稀释法将加热处理后的瘤胃液稀释至10-7；分别吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀释液均匀涂布于NA固体培养基表面，每个稀释度3个平板。37℃培养24 h后，根据菌落形态特征区分，挑取形态差异的单菌落进行纯化并保藏（Wang等，2021）。

1.2.2 产酶活性测定 纤维素酶活测定：采用CMC糖化力法对各菌株发酵液中纤维素酶活力进行测定（李兰晓等，2006）。纤维素酶活力单位定义为1 mL酶液在40℃、pH 4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na）产生1.0 μg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/mL表示（蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999）。试验重复3次，每次3个平行。

蛋白酶活力测定：测定方法参照中华人民共和国专业标准SB/T10317-1999中的福林法（蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999）。酶活定义单位为1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。试验重复3次，每次3个平行。

α-淀粉酶活力测定：参照测试盒使用说明书（C106-1-1，南京建成生物工程研究所）采用淀粉-碘比色法测定各菌株的α-淀粉酶活力。酶活单位定义为100 mL上清液中的淀粉酶，在37℃与底物作用30 min，水解100 mg淀粉为1个单位（U/100 mL）。

1.2.3 抑菌活性测定 病原菌指示菌菌液制备：取斜面保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌于NA固体培养基划线，37℃活化12 h；挑取单菌落接种至装有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中经37℃、180 r/min振荡培养24 h；通过稀释涂布法计数并将各病原指示菌的浓度调节为1×107cfu/mL，4℃保存备用。

芽孢杆菌发酵上清液的制备：取斜面保存的芽孢杆菌菌株于NA固体培养基划线，37℃活化12 h；挑取单菌落接种至装有50 mL LB液体培养基的锥形瓶中经37℃、180 r/min振荡培养12 h制备种子液；按1%体积的接种量接种于装有50 mL的LB液体培养基的锥形瓶中经37℃、180 r/min振荡培养24 h制备发酵液；发酵液经4℃、12000 r/min离心10 min后弃去菌体，吸取上清液过0.22 μm无菌滤膜后4℃保存备用。

抑菌试验：分别吸取100 μL各病原指示菌菌液，均匀涂布于NA固体平板上；用无菌镊子将牛津杯放置在平板上；向牛津杯中加入200 μL发酵上清液，处理完成后小心将平板转移至37℃培养箱内静置培养24 h后测量抑菌圈直径。以无菌LB液体培养基为空白对照，试验共重复3次，每次3个平行。

1.2.4 菌种鉴定 菌株的生理生化采用Biolog-GEN-III微孔板法进行鉴定：将与NA固体培养基活化12 h的菌株接种于TSA固体培养基，33℃培养16 h后用无菌一次性棉签沾取单菌落接种于IF-B接种液中，搅拌均匀并用浊度计调节细胞浓度为90%～98%T。将菌悬液倒入无菌的V型槽中，并用移液器转移至微孔板，每孔100 μL。将微孔板在33℃培养24 h后，采用MicroStation自动微生物鉴定分析系统分析菌株生理生化特征并于标准菌株数据库进行比对（Li等，2019）。分子生物学鉴定：将菌株于NA固体培养基活化12 h后，挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养12～16 h后获得菌悬液。参照试剂盒（CW0552，康为世纪）使用说明收集菌体并提取细菌基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）及1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGCTT-3′）进行扩增，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（王建宇等，2021）。扩增体系为25 μL，其中基因组DNA模板2 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，2×Easy-TaqRPCR SuperMix（AS111，北京全式金生物）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共34个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经纯化后委托上海生工生物工程股份有限公司完成测序，将获得的序列在NCBI上BLAST比对并用Mega 6.0软件进行聚类分析，采用邻接法构建系统发育树，重复1000次进行自展值分析（王建宇等，2021）。

2 结果

2.1 菌种筛选 通过纯培养的方法，根据菌落形态区分，结合菌体产芽孢的镜检结果，从健康奶牛瘤胃样品中共分离获得22株芽孢杆菌，编号如表1所示。

2.2 产酶活性 对分离得到的22株芽孢杆菌的产酶活性进行了测定，结果表明具有产纤维素酶活性的菌株有15株，产蛋白酶活性的菌株有17株，所有分离菌株均有产淀粉酶活性，能够同时产三种酶的菌株有12株；其中芽孢杆菌BX1-12产酶活性最高，其纤维素酶、蛋白酶及淀粉酶活性分别为27.33、137.54 U/mL以及1450.53 U/100 mL（表1）。

表1 22株芽孢杆菌产酶活性

2.3 抑菌活性 由表2可知，22株芽孢杆菌均具有一定的抑菌活性，能够抑制大肠杆菌的菌株有12株，其中S2Y-5活性最强，抑菌圈直径为18.02 mm；13株菌具有拮抗金黄色葡萄球菌活性，15株菌能够抑制伤寒沙门氏菌，其中芽孢杆菌BX1-12对两种病原菌的抑制活性最强，抑菌圈直径分别为23.21、25.97 mm。此外，BX1-12对大肠杆菌也具有抑制效果，表现出广谱的抗菌性。

表2 22株芽孢杆菌对三种病原指示菌的抑菌圈直径mm

2.4 芽孢杆菌BX1-12鉴定

2.4.1 生理生化鉴定 综合产酶及抑菌活性，对菌株BX1-12进行了系统鉴定。部分Biolog生理生化实验结果如表3所示，该菌株能够利用蔗糖、糊精、D-纤维二糖、D-半乳糖、龙胆二糖、L-天冬氨酸等生长因子；化学敏感试验中，菌株能够耐受四唑紫、溴酸钠、1%乳酸钠、氯化锂、4% NaCl等物质。经Biolog-GEN-III微孔板法鉴定，该菌与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似度最高。

表3 芽孢杆菌BX1-12生理生化测定结果

2.4.2 分子生物学鉴定 将菌株BX1-12 16S rRNA序 列在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行同源性比较并构建了菌株的Neighbor-Joining进化树。结果如图1所示，该菌与枯草芽孢 杆 菌 （Bacillus subtilis）DSM 22148T（HE582781）同源性为97%。结合Biolog生理生化特性，该菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌。

图1 基于16S rRNA序列采用邻接法构建菌株BX1-12以及其他相关菌株的系统进化树

3 讨论

芽孢杆菌是自然界中常见的一种微生物，由于其抗逆性强、功能多样、产业化性能好等优点广泛应用于养殖业、种植业等领域（龚慧等，2014）。目前，常见的作为饲料添加剂使用的芽孢杆菌的种类主要有枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌等，其中枯草芽孢杆菌是目前研究、应用最多的菌种之一，同时也是农业农村部许可使用的安全菌株（成廷水等，2012）。例如，林显华等（2013）发现在饲料中添加枯草芽孢杆菌B7能够使肉鸡增重，并改善肉鸡机体免疫力。

虽然枯草芽孢杆菌的功能在养殖业中已得到广泛认可，但多集中在鸡和猪的应用上，在反刍动物养殖上的研究相对较少（郝生宏等，2015）。此外，动物微生态制剂能否发挥作用很大程度上取决于其在动物胃肠道中的定植量，而宿主的生理条件通常会影响菌种的增殖（张新雄等，2013）。基于此，本研究以原位筛选为原则，从健康奶牛瘤胃液中共分离得到22株芽孢杆菌，为奶牛用微生态制剂开发积累了重要的菌种资源。

饲用微生态制剂主要的功能之一是能够合成并分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等酶类，从而促进饲料的消化吸收，减少畜禽因消化不良引起的腹泻，此外，功能菌种还能够抑制病原菌，提升畜禽的抵抗力（张吉鹍等，2019）。本研究系统评价了22株芽孢杆菌的产酶、抑菌活性并从中发现一株枯草芽孢杆菌BX1-12，该菌具有高产酶活及广谱抑菌活性，应用潜力较好，因此如何将该菌开发成为饲用微生态制剂是后续研究的重点。

4 结论

本试验以健康高产奶牛瘤胃液为研究对象，以产酶（纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶）、抑菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌）活性为评价指标，获得了一株能够高效产酶及广谱抑菌的芽孢杆菌，编号为BX1-12，经鉴定该菌为枯草芽孢杆菌，并为饲用芽孢杆菌奶牛微生态制剂的研究和开发提供科学依据，积累了宝贵的菌种资源。