复合菌颗粒料对犊牛瘤胃发酵参数及菌群结构的影响

2022-09-29张巧娥张转弟李云鹤

中国饲料 2022年19期

王庆，张巧娥*，张转弟，李月，李云鹤，封元

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区畜牧工作站，宁夏银川 750001）

抗生素作为一种非营养性饲料添加剂，有着促进动物生长、提高动物繁殖性能和存活率、降低疾病发生率、提高饲料转化效率、降低饲料成本的作用（Dong等，2021）。但其会提高细菌对药物耐药性，从而使畜禽免疫力降低，导致内源性感染；并且还会引起过敏反应、肠道菌群失调、以及“致癌、致畸和致突变”等；同时，大多数抗生素与畜禽粪尿一起排放到环境中后仍保持活性，对土壤微生物、水生生物和昆虫均有不利影响（纵瑞等，2021；张利珍，2019；王亚书等，2019；Allen等，2013；Frizzoa等，2011）。自2020年我国农业农村部发布第194号公告开始全面禁止抗生素的使用以来，研究学者开始探索可以完美替代抗生素的产品，其中益生菌是目前公认的最有前景的抗生素替代品（杨柳青，2020）。益生菌主要通过竞争排斥、直接抗菌抑制、宿主免疫反应的调节、增强肠道固有免疫力、提高营养物质消化率、减少腹泻和抗毒素作用以及刺激或抑制获得性免疫等方法来提高动物生产性能（Beulah等，2020）。常用菌群有：酵母菌群、芽孢杆菌、乳酸菌群、革兰氏阳性放线菌群等（李洵，2021；Vicini等，2019；Red等，2018）。

研究发现复合菌对犊牛瘤胃菌群结构存在一定的影响。Zhang等（2017）研究发现，通过添加复合菌饲喂犊牛，瘤胃发酵特性无显著差异。16S rRNA V3区扩增片段的凝胶电泳分析结果表明，56日龄断奶前，微生态制剂对瘤胃细菌群落没有影响。但于萍等（2009）的研究表明，饲粮中添加纳豆芽孢杆菌，可以促进犊牛消化系统中的琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和脂解厌氧弧杆菌的定植与生长。刘程等（2020）的研究表明，每头牛日粮中添加由地衣芽孢杆菌（活菌数≥1.0×109cfu/g）、枯草芽孢杆菌（活菌数≥2.0×109cfu/g）和米曲霉（活菌数≥2.0×104cfu/g）组成的复合益生菌20 g后，在门水平上，试验组和对照组相对丰度前10的菌门均无显著差异；在属水平上，试验组琥珀酸菌属相对丰度显著高于对照组，瘤胃球菌属相对丰度提高42.1%，琥珀酸弧菌属相对丰度显著低于对照组。但是，目前关于酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌对犊牛瘤胃方面的研究较少，所以，本试验将立足于前人的研究基础之上，探究复合菌颗粒料对犊牛瘤胃发酵参数和菌群结构的影响，为指导生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计试验于2020年7月6日至10月16日在宁夏壹泰牧业有限公司进行。选择20头出生年龄相近（7日龄）且健康的安格斯犊牛，随机分为2组，其中对照组10头，试验组10头，经t检验分析，两组体重差异不显著（P＞0.05）[（27.7±2.85）kg]。犊牛出生后称重，出生后0.5～1.0 h进行人工诱食，随后初乳后自然哺乳，7 d后诱食颗粒料。试验使用犊牛颗粒料，其原料组成为：玉米、豆粕、棉籽粕、膨化大豆、磷酸氢钙、维生素预混合饲料、微量元素预混合饲料等，各种原料营养水平见表1。对照组饲喂该颗粒料；试验组在对照组的基础上添加商品型1%复合菌（酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌）颗粒料，活菌数为3×108cfu/g，试验期间两组自由采食，记录每天颗粒料采食量，自由饮水。每日少量多次添加，试验期共100 d，其中预饲期10 d，正试期90 d。

表1 颗粒料营养水平（干物质基础）

1.2 测定指标与方法在试验结束当天早晨犊牛空腹时，每组随机选取6头犊牛用瘤胃液采集器从口腔采集瘤胃液50 mL（弃去前20 mL），未经纱布过滤直接装于冻存管以保证瘤胃液中菌群的完整性。之后液氮保存并及时送回实验室备测。

1.2.1 瘤胃发酵参数测定参照王敬尧（2019）方法采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨氮浓度（NH3-N），采用pH剂测定瘤胃液pH，采用考马斯亮蓝法测定菌体蛋白（MCP），采用气相色谱仪测定瘤胃液的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸以及总挥发性脂肪酸含量。

1.2.2 瘤胃微生物多样性测定将在液氮中冻存的瘤胃液送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。具体流程为：将瘤胃液4℃解冻后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA，合成带有barcode的特异引物，其序列为：上游引物338F：5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3"；下游引物806R：5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"。切胶回收PCR产物后用QuantiFlourTM-ST荧光定量，最后在MiSeq PE-300平台进行测序。

1.3 数据处理与分析试验数据先通过Excel 2007进行初步整理，然后使用SAS 8.1统计软件进行单因素方差分析。最终结果以“平均值±标准差”表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 复合菌颗粒料对瘤胃发酵参数的影响由表2可知，复合菌颗粒料饲喂犊牛后瘤胃内MCP含量可以显著提高0.37 mg/mL（P＜0.05），而氨态氮、pH、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、乙酸/丙酸以及总挥发性脂肪酸含量均表现为对照组与试验组差异不显著（P＞0.05）。

表2 复合菌颗粒料对瘤胃发酵参数的影响

2.2瘤胃菌群结果

2.2.1 OTUs比较由图1可知，Illumina M iSeq测序后对12个犊牛瘤胃液样本按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。结果显示：对照组共含有1230个OTUs，试验组共含有1354个OTUs，其中，试验组（B1）和对照组（A1）共同含有的OTUs数是1096个，对照组特有的OTUs数是134个，试验组特有OTUs显著高于对照组，有258个。说明试验组和对照组瘤胃液菌群组成有差异。

图1 Venn图

2.2.2 细菌稀释曲线试验组（B1）与对照组（A1）样本的OTUs稀释曲线结果如图2所示，结果表明：随着测序深度逐渐递进，试验组和对照组的OTUs数量和物种丰富度表现一致，在刚开始时OTUs数量陡然上升，之后达到平缓期。表明测序深度已基本覆盖样品中的细菌物种，测序数量足够，结果可以反映菌群的大部分真实信息。

图2 OTUs稀释曲线

2.2.3 α多样性分析由表3可知，复合菌颗粒料对瘤胃α多样性指数均有影响，试验组的Sobs指数和Ace指数分别显著高于对照组217.73和242.93（P＜0.05）；试验组的Shannon指数极显著高于对照组0.81（P＜0.01）；试验组的Chao指数极显著高于对照组263.39（P＜0.01）；对照组Simpson指数显著高于试验组0.04（P＜0.05）；而试验组和对照组的覆盖率差异不显著（P＞0.05）。

表3 复合菌颗粒料对瘤胃微生物菌群多样性的影响

2.2.4 细菌样本PCoA分析主坐标分析（PCoA）用来表示每个瘤胃液样品间的差异，当瘤胃液中物种组成差异越大时图中样品的间距就会越远。从图3可以看出，在PC1和PC2的分别为53.05%、37.06%时，对照组（A1）和试验组（B1）的间距较远，说明2组菌群差异性较明显。除对照组的A5样品和试验组的B5样品与本组的距离较远外，组内其他样品距离都较近，说明组内菌群差异性较小。

图3 PCoA图

2.2.5 细菌物种门水平相对丰度从表4可知，对照组和试验组均由拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetota）以及其他相对丰度＜1%的共18种菌门组成。表中所列菌门中两组间的差异均不显著（P＞0.05）。其中拟杆菌门都是两组的优势菌门，但试验组较对照组提高了8.68个百分点。

表4 复合菌颗粒料对瘤胃门水平上菌群结构的影响（相对丰度＞1%）%

2.2.6 细菌物种属水平相对丰度由表5可知，在属水平上对照组和试验组的优势菌属都是普雷沃菌属（Prevotella），但对照组的第二优势菌属是理研菌科_RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group），试验组的第二优势菌属是未分类_f_Muribaculaceae（norank_f_Muribaculaceae），其相对丰度均在5%以上。表中所列菌属中除试验组的普雷沃氏菌科_UCG-003群（Prevotellaceae_UCG-003）和普雷沃氏菌科_UCG-001群（Prevotellaceae_UCG-001）显著高于对照组（P＜0.05）外，其他各项两组间差异均不显著（P＞0.05）。

表5 复合菌颗粒料对瘤胃属水平上菌群结构的影响（相对丰度＞1%）%

2.2.7 瘤胃细菌群落与瘤胃发酵参数的关系利用相关性分析得相关性Heatmap图，评估了瘤胃细菌属与瘤胃发酵参数之间的相关关系。如图4所示，乙酸与norank_f_Muribaculaceae呈正相关（P＜0.05），与Rikenellaceae_RC9_gut_group呈弱负相关（P＜0.05）；丙酸与Ruminococcus呈负相关（P＜0.05），与Rikenellaceae_RC9_gut_group呈强负相关（P＜0.05）；丁酸与norank_f_Murib-aculaceae呈正相关（P＜0.05）；戊酸与Olsenella呈弱正相关（P＜0.05），与Succiniclasticum呈强正相关（P＜0.05）；总挥发性脂肪酸与norank_f_Muribaculaceae呈正相关（P＜0.05），与Rikenellaceae_RC9_gut_group呈负相关（P＜0.05）。

图4 瘤胃细菌属（相对丰度最高的10个菌属）相对丰度与瘤胃发酵参数相关性分析

3 讨论

3.1 复合菌颗粒料对瘤胃发酵参数的影响颗粒料中的含氮物质是瘤胃液中NH3-N的主要来源。而NH3-N浓度主要取决于瘤胃对含氮物质的降解率和吸收率（李岚捷等，2017；Ruselljb等1992）。本试验中对照组和试验组NH3-N浓度分别为13.70 mg/L和11.54 mg/L，差异不显著，说明两组犊牛对颗粒料中含氮物质的降解率和吸收率无差异。MCP是反刍动物小肠中部分氨基酸的重要前体物，适量的MCP可平衡氨基酸的利用以降低蛋白质饲料的使用，并能促进犊牛生长发育。本试验中两组MCP含量存在显著差异，表现为试验组显著高于对照组，与谢建林等（2021）研究结果相同，并且MCP含量均比聂练等（2019）研究复合菌组60 d测得0.42 mg/mL高出1.92 mg/mL。可能是复合菌颗粒料中的益生菌提高了犊牛瘤胃中微生物多样性，进而使试验组MCP含量较对照组的高（郭凯等，2019）。颗粒料中的碳水化合物会在瘤胃微生物的发酵作用下分解产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸物质，然后为犊牛提供葡萄糖前体物和脂肪等，从而为犊牛机体提供70%～80%的能量（凌浩等，2021）。在本试验中虽然两组的挥发性脂肪酸间均无显著差异，但整体表现为试验组略高于对照组，表明给犊牛饲喂复合菌颗粒料有助于机体分解葡萄糖和淀粉等物质以提高能量的利用。

3.2 复合菌颗粒料对瘤胃菌群结构的影响虽然犊牛瘤胃内微生物体系还没有完全成型，但还是可以通过高通量测序来确定犊牛瘤胃内微生物菌群结构和种类（李常瑞，2017），进而探究复合菌颗粒料对犊牛瘤胃菌群结构的影响。Venn图可以直观得观察在97%水平下独有和共同的OUT数，即观察两组样品是否存在差异。本试验就是基于两组样品的Venn图存在差异的情况下继续探究复合菌颗粒料对瘤胃菌群结构的影响。

就α多样性指数而言：Sobs指数、ACE指数和Chao指数可反映菌群丰富度，且和菌群丰富度呈正相关；Simpson指数和Shannon指数可综合反映菌群的多样性和均匀度，而Simpson指数与菌群多样性呈负相关，Shannon指数与菌群多样性呈正相关，即当Simpson指数越小、Shannon指数越大时瘤胃液菌群多样性越大（Jami等，2013）。本试验中试验组的Sobs指数、ACE指数、Chao指数和Shannon指数均显著高于对照组，对照组Simpson指数显著高于试验组，与Hu等（2020）研究结果一致。并且与β多样性分析相结合表明给犊牛饲喂复合菌颗粒料可以显著增加瘤胃内菌群的丰富度以及多样性，为降解吸收营养物质提供基础。

3.3 复合菌颗粒料对瘤胃菌群门水平的影响对瘤胃菌群结构的研究表明拟杆菌门和厚壁菌门是瘤胃中的优势菌群（吴琼等，2020；Wu等，2020；Hein等，2020），本试验共测得的18个门中优势菌群与这些研究结果相同。本试验拟杆菌门占比达到60%以上，为第一优势菌群，但是这些菌群也是机会性致病菌群，当犊牛体内正常的微生态平衡被外界环境打破时这些菌群有可能会引起犊牛机体内源性的发病（Li等，2017）。同时，拟杆菌基因编码的外周蛋白SusC和SusD可以调节淀粉与细菌表面的接触，从而起到分解多糖的作用（Fredrik等2004），本研究中虽然两组间拟杆菌门丰度差异不显著，但表现为试验组比对照组略高，这也是瘤胃中试验组丙酸含量比对照组高的原因。说明饲喂复合菌颗粒料有助于犊牛对多糖物质的分解。同时Evans等（2011）研究发现，厚壁菌门具有参与分解纤维物质的作用，从而促进瘤胃内乙酸和丁酸的产生，本试验中试验组和对照组的厚壁菌门丰度以及乙酸和丁酸的含量之间差异均不显著，表明复合菌颗粒料对厚壁菌门无显著影响，但从乙酸和丁酸含量的结果来看，试验组的乙酸和丁酸含量均略高于对照组，这可能是瘤胃内其他菌群的作用导致，具体还有待研究。

3.4 复合菌颗粒料对瘤胃菌群属水平的影响在属水平上，本试验共测得241个属，而相对丰度大于1%的只有20种。其中普雷沃氏菌属为第一优势菌属，这与陈林（2020）研究结果一致。而Purushe等（2010）和Matsui等（2000）研究发现，普雷沃氏菌属具有多重功能和多个基因型，具有裂解寡糖、蛋白质和淀粉以及降解半纤维素的功能，另外有研究表明，普雷沃氏菌属可以在瘤胃中消耗氢，可以通过丙烯酸和琥珀酸途径发酵糖类物质而产生丙酸（Flinth，2008）。本试验中试验组的普雷沃氏菌科_UCG-003群和普雷沃氏菌科_UCG-001群均显著高于对照组，说明复合菌颗粒料可以提高普雷沃氏菌的相对丰度，从而促进犊牛对寡糖、蛋白质等物质的利用以及产生更多的丙酸为机体提供能量，进而促进犊牛的生长发育。

3.5瘤胃细菌群落与瘤胃发酵参数的关系本试验分析了瘤胃菌属中前10相对丰度的菌属与瘤胃发酵参数之间的相关性关系。其中有9个菌属相对丰度与瘤胃发酵参数呈显著关系。与其他瘤胃发酵参数相比，本试验中更多菌属与乙酸、丙酸、丁酸、戊酸以及总挥发性脂肪酸显著相关，本结果与陈林（2020）研究结果相似，但与曾钰等（2020）研究结果存在差异，这可能是因为品种以及饲料类型等因素的影响。但主要都是表现为乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸与瘤胃菌属之间有相关关系。所以挥发性脂肪酸的水平可能是影响瘤胃菌群的关键因素，瘤胃菌群可通过发酵作用产生挥发性脂肪酸，进而刺激犊牛瘤胃的发育（Rey等，2014）。本试验结果说明乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的含量对norank_f_Muribaculaceae有促进作用，对Rikenellaceae_RC9_gut_group有抑制作用，说明挥发性脂肪酸的浓度与瘤胃菌群的组成密切相关。