低分子有机酸对林地土壤磷释放及活化影响

张金昕，高良敏*，庞振东，陈晓晴，王慧，童荣荣

(1.安徽理工大学地球与环境学院，淮南 232001；2.淮南市环境保护监测站，淮南 232001)

磷是生态系统中植物及农作物所必需的限制性营养元素之一[1-2]，甚至有可能影响生态系统的进化[3-4]。王永壮等[5]研究表明，中国各种不同类型的农田土壤中全磷含量为0.31～1.72 g/kg，平均为0.68 g/kg。过量施用磷肥会导致土壤磷素累积，全磷含量升高，但是磷肥进入土壤后容易被碳酸钙和铁、铝氧化物吸附固定，加上降水、土壤有机组分等影响，其有效磷含量往往较低[6-7]。所以，提高磷肥的利用率是当前的一个热点问题。

近年来，越来越多的学者关注根系分泌物对土壤磷有效性的影响。研究发现根际效应显著提高了磷有效性[8-10]。柠檬酸、草酸和苹果酸是植物根际环境中众多类型低分子有机酸中最常见，因其具有毒性低及降解性高等特点被广泛研究[11]。低分子有机酸可促进土壤磷的转化，增强其有效性，增加植物对土壤磷的吸收[12-15]。潘复静等[16]通过实验证明了有机酸对土壤养分有效性提高有明显作用。文献[17-19]开展了低分子有机酸对土壤及矿石中各形态磷的吸附﹑解吸实验。Zhu等[20]研究表明，低分子量有机酸能够显著促进青藏高原东部亚高山森林根际土壤有效磷的有效性。Fu等[21]研究表明，添加丙二酸可以提高石灰性土壤磷肥的有效性。

基于此，采用实验室模拟试验方法，以柠檬酸、草酸和苹果酸3种低分子有机酸为研究对象，探讨了意杨林灰潮土壤在这3种酸不同浓度及处理时间下土壤磷的释放及活化影响。旨在为科学评价有机酸在森林养分循环系统中的作用提供参考，同时为磷肥的合理施用和土壤有效磷的提升提供基础数据和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用土壤为意杨林0～20 cm的表层灰潮土，将采集的土壤样品进行风干，风干后研磨过100目筛网，备用。采样点位于淮河流域王家坝闸对岸固始县意杨林(115°36′23″N，32°25′3″E)，其成土母质为近代淮泛冲积物。固始县在淮河的南岸，土地由山地、丘陵、平原构成。地势南高北低，从西南向东北倾斜，坡降为1/1 200，是中国的南北气候过渡地带，气候较湿润，雨量充沛。

原始土壤性质参照《土壤农业化学分析方法》[22]中相关方法测定，测定结果为土壤pH为7.3，呈中性；土壤含水率为1.8%；电导率 35.93 μs/cm；土壤总磷(total phosphorus,TP)含量为914 mg/kg。

考虑到根际土壤中低分子有机酸平均含量及施用有机酸的可能性，实验室中用分析纯药品分别配制低、中和高浓度分别为1 mmol/L苹果酸、3 mmol/L 柠檬酸及5 mmol/L草酸。

1.2 试验方法

分别称取备用土样3.0 g装入50 mL的离心管，按1∶10的固液比分别添加30 mL的1 mmol/L苹果酸、3 mmol/L柠檬酸及5 mmol/L草酸，为抑制微生物活性加入2滴百里酚，然后恒温25 ℃以 200 r/min 振荡30、60、90、120、150、180、210、240 min，使之混合并充分反应，之后再将满足实验时间的离心管放入离心机，设置转速4 000 r/min、时间为10 min，开始离心，最后取上清液参照《水质 总磷的检测 钼酸铵分光光度法》(GB/T 11893—1989)测定TP浓度，此时定义计算的结果为土壤TP释放量。

之后再将离心管中的残留物用蒸馏水清洗两遍，借助离心机使残留物快速沉积加速清洗。再采用沉积物磷形态测试方法SMT(the standards,measurements,and testing)法[23]分级测定土壤中TP、无机磷(inorganic phosphorus,IP)、有机磷(organic phosphorus,OP)、Fe/Al-P和Ca-P含量，此处定义测出值为土壤磷活化量。土壤磷素测定法的基本原理是利用不同的化学萃取物，逐步分离出不同形态的无机磷素。TP活化量具体操作步骤为：先将洗净后的残留物倒至瓷坩埚，将坩埚放入马弗炉中灼烧3 h，温度设置为450 ℃。待坩埚冷却后用玻璃棒将烧制的残留物捣碎并倾倒至50 mL离心管，用 20 mL 3.5 mol/L的盐酸提取液加入坩埚转移残留样品，将离心管固定在恒温振荡箱中，设置温度 25 ℃、转速160 r/min以及时间16 h，然后开始振荡。再将满足实验时间的离心管放入离心机，设置转速为4 000 r/min、时间为10 min，之后取5 mL上清液至50 mL比色管中定容至刻度线，加药用紫外分光光度计测定。IP用1.0 mol/L HCl溶液浸提；对于OP，将测定IP过程中离心得到的残渣清洗后，在450 ℃下灼烧后用1.0 mol/L HCl溶液浸提；Fe/Al-P则是在1 mol/L NaOH溶液和3.5 mol/L HCl溶液中提取；Ca-P则是将Fe/Al-P测定中氢氧化钠提取后的残渣以1 mol/L氯化钠溶液清洗两遍，再用1.0 mol/L盐酸溶液浸提后测出。每组实验三组平行。

1.3 数据计算及分析

土壤TP释放量计算公式为

A=CV/m

(1)

式(1)中：A为TP释放量，mg/kg；C为TP浓度，mol/L；V为加入的溶液体积，mL；m为土壤质量，g[24]。

土壤TP释放率计算公式为

R=A/T×100%

(2)

式(2)中：R为土壤TP释放率，%；T为原土壤TP含量，mg/kg。

土壤磷活化量计算公式为

B=T-M

(3)

式(3)中：M为土壤在低分子有机酸作用下各形态磷含量，mg/kg；B为土壤各形态磷变化量，mg/kg，B<0表示低分子有机酸对土壤磷具有固化作用；B>0表示低分子有机酸对土壤磷具有活化作用[25]。

土壤磷活化率计算公式为

Rac=B/T×100%

(4)

式(4)中：Rac为土壤各形态磷活化率，%。

采用Excel及SPSS 26进行数据统计分析，使用Origin 2018进行相关图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 低分子有机酸对土壤TP释放的影响

在低分子有机酸作用下灰潮土TP释放变化如图1所示。3种有机酸均能明显促进土壤TP的释放，在相同酸浓度条件下，有机酸释放灰潮土TP能力为草酸>柠檬酸>苹果酸。且随着酸浓度的增高，土壤TP的释放量增大。在高浓度时，苹果酸、柠檬酸及草酸对土壤TP的释放量最大值分别为2.488、4.757、5.099 mg/kg，3种酸对土壤TP释放率分别增长了180%、161%和217%。浓度为 5 mmol/L 时，草酸的pH达到最小，为2.743，酸性大于柠檬酸(2.892)及苹果酸(3.131)，草酸酸性最强，故释放土壤固定的TP能力最强。TP释放量随实验时间变化趋势还未出现最高值点，需要需更深入的研究，以确定在不同条件下TP释放量达到最大值时的反应时间。

图1 不同有机酸对土壤TP释放的影响Fig.1 Effects of different organic acids on TP release in soil

2.2 低分子有机酸对土壤不同形态磷活化的影响

2.2.1 苹果酸对磷活化的影响

低分子有机酸和土壤中的铁、铝等氧化物之间发生相互作用可以降低土壤对有机物的吸附。此外，有机酸的pH约为3，可溶解难溶性含磷化合物，有机酸中的阴离子与Fe、Al和Ca等金属离子之间也存在相互作用，从而活化土壤中的磷。苹果酸对灰潮土磷的影响如表1所示，苹果酸均能显著活化灰潮土中的IP、OP、Fe/Al-P及Ca-P，其中对IP活化量最大，活化作用最强，苹果酸对灰潮土IP活化作用随浓度升高反而降低，对OP、Fe/Al-P及Ca-P均是在中浓度时活化量最大，但有机酸处理时间对磷活化作用影响不明显。

表1 苹果酸对不同形态磷活化的影响Table 1 Effects of malic acid on activation of different phosphorus forms

2.2.2 柠檬酸对磷活化的影响

不同浓度的柠檬酸对灰潮土处理后4种形态磷的变化如表2所示。低、中和高浓度下柠檬酸对土壤磷的作用一致，均为显著活化作用。活化量大小为IP最大，Ca-P与Fe/Al-P次之，OP活化量最小。低浓度时，柠檬酸对土壤OP及Ca-P的活化量随时间增加而减小。总体上柠檬酸对灰潮土的活化能力与苹果酸相似。IP与Fe/Al-P在低浓度时活化效果最好，随着酸浓度的增加，活化作用反而有所降低，但OP活化量随浓度增加而增加。

表2 柠檬酸对不同形态磷活化的影响Table 2 Effects of citric acid on activation of different phosphorus forms

2.2.3 草酸对磷活化的影响

草酸在中等浓度时更有利于土壤磷的活化，如表3所示，草酸在低和高浓度时对土壤OP起固定作用而在中浓度时对灰潮土OP起活化作用。在草酸对土壤Ca-P活化实验中可以得到草酸浓度越高活化能力越强。磷可能通过草酸钙的形成和沉淀从各种磷酸钙矿物中释放出来，草酸盐之间的反应是快速的，因此草酸盐介导的磷从土壤中的释放也同样迅速。由于土壤中含磷的矿物质和金属等对不同有机酸反应时间及速率存在影响，最终导致柠檬酸和苹果酸对土壤磷的活化比草酸有效得多。

表3 草酸对不同形态磷活化的影响Table 3 Effects of oxalic acid on activation of different phosphorus forms

2.2.4 有机酸对TP活化影响

图2为低分子有机酸对土壤TP平均活化量影响柱状图。3种酸对TP活化能力为苹果酸≥柠檬酸>草酸，而它们第一解离常数分别为3.40、3.14和1.20，说明第一解离常数越大，有机酸活化能力越强。唯一不同的是，草酸浓度越高土壤TP活化量越低，说明草酸随浓度升高对土壤磷的活化作用降低，到一定浓度时对土壤磷有固化作用，2.2.3节中草酸在高浓度时对OP起固化作用。不同种类有机酸对土壤TP活化量及活化率变化结果如图3所示。

不同大写字母表示有机酸相同而浓度不同时差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示浓度相同而有机酸不同时差异显著(P<0.05)图2 低分子有机酸对土壤TP活化的影响Fig.2 Effects of low molecular organic acids on soil TP activation

苹果酸对土壤TP的活化率最高为76.5%；柠檬酸在浓度最大时活化率略有减小，平均活化率为64.1%；而草酸对土壤TP的活化率则与浓度呈反比，最低仅为24.5%。柠檬酸和苹果酸比草酸表现出更强的活化作用原因可能是柠檬酸盐、苹果酸盐及草酸盐有利于形成具有三价阳离子(如Al3+和Fe3+)的稳定5键或6键环结构[26]，这解释了活化TP中包含的Fe/Al-P是中等不稳定的磷，其通过化学吸附更牢固的保持在Fe和Al氧化物的表面[27]，但柠檬酸和苹果酸相对于草酸有更强的亲和力，在酸性土壤中占主导地位，从而比草酸表现出更强的活化能力。

灰潮土在苹果酸和柠檬酸处理下，有机酸浓度从1 mmol/L增加到3 mmol/L时，随着酸浓度的增高，土壤TP活化量增高。这与刘娜[28]的研究结果相似，认为一定浓度下有机酸对土壤磷的活化能力随浓度的增大而增强。而草酸在低浓度时更有利于土壤磷的活化，如图3(c)所示，随着酸浓度的增高，草酸对土壤TP的活化作用在不断减小，所以草酸对灰潮土TP的最佳活化作用的浓度还需更细致的研究。

图3 TP活化量及活化率变化Fig.3 Changes of TP activation quantity and activation rate

2.3 土壤TP释放与活化关系

不同低分子质量有机酸在不同条件下对土壤TP释放量与活化量之间关系如图4所示。可以看出，土壤TP释放量与活化量之间呈反比关系，即相同实验条件下土壤TP释放量越大，其活化量就越小，原因可能是有机酸对土壤磷活化能力有限，活化总量一定，当释放量增大时，所剩余的活化量就减小。释放量与活化量之间拟合曲线方程为y=-15.67x2-0.73x+666.61，R2=0.79，表明低分子有机酸对土壤TP释放量及活化量之间呈现较强的负相关关系。

图4 土壤TP释放量与活化量之间的关系Fig.4 Relationship between TP release and activation in soil

2.4 各因素间相关性分析

2.4.1 相关性分析

由表4可知，低分子有机酸实验中土壤磷释放量及活化量与有机酸酸种类、浓度及处理时间均有一定相关性。其中TP释放量与酸种类和酸浓度的相关性系数为0.694和0.529，均为显著正相关，而TP活化量则与这两种因素呈负相关关系。TP释放量与TP活化量之间的相关性系数为-0.623，进一步证明了前面的结论。酸种类与所有形态磷均呈显著性相关关系，各形态磷之间的相关性也很强。磷的释放量及活化量随处理时间相关性不显著，原因是实验时间较短，而有机酸对土壤磷的释放和活化是很缓慢的过程，所以对于实验时间这个因素还有待进一步研究。

表4 低分子质量有机酸实验各因素相关性分析Table 4 Correlation analysis of various factors in low molecular weight organic acid experiment

2.4.2 方差分析

利用SPSS将数据进行正态性检验以及方差齐性检验，根据柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫检验得到的显著性检验P值均比0.05大，说明数据为正态分布；根据单因素ANOVA检验，基于中位数的方差齐性检验显示P>0.05，因此数据满足方差齐性假设。综上数据符合所有方差分析的前提假设，可以进行方差分析。

分别将土壤TP释放量及活化量作为因变量，酸种类、酸浓度以及处理时间作为自变量，然后进行方差分析，结果如表5所示。灰潮土壤的多因素方差分析检验的原假设是各因素对土壤中TP释放量及活化量没有显著性影响，取检验的显著性水平为α<0.05。

从表5可以看出，3个因素及各因素交互作用的检验P值都小于0.05，表明这些因素对TP释放、活化及其交互作用均有显著影响。这与陈立新等[25]研究结果相同，土壤无机磷含量变化与磷形态、有机酸的种类、培养时间及林型等因素均相关。

表5 灰潮土酸种类、酸浓度及处理时间多因素方差分析Table 5 Analysis of variance of acid species,acid concentration and treatment time in gray aquic soil

从单因素贡献的Ⅲ类平方和来看，酸种类贡献大于其他因素，因此酸种类对灰潮土壤TP释放量及活化量变化影响最显著。

3 结论

(1)3种低分子有机酸对固始县意杨林表层灰潮土壤中的磷均有显著的释放和活化能力，释放能力强弱为：草酸>柠檬酸>苹果酸；而综合活化能力则为：苹果酸≥柠檬酸>草酸，其中草酸在高浓度时对土壤磷有固化作用。苹果酸和柠檬酸对IP活化作用最强，Ca-P与Fe/Al-P次之且活化作用相当，OP最小。草酸则是对Fe/Al-P活化效果强于Ca-P。

(2)灰潮土壤中磷释放及活化受有机酸的种类、有机酸浓度和处理时间等因素的交互影响。本研究中对于灰潮土壤的磷释放量及活化量影响最显著的因素是有机酸的种类，其次是有机酸的浓度和处理时间。磷素在土壤中被固定转变为无效磷，而将无效磷重新转化为有效磷是一个缓慢的过程，会受到土壤矿物、有机质、pH和微生物等一系列因素影响，所以对于有机酸活化土壤磷还需要考虑更多因素进行更深入研究。