3株枯草芽孢杆菌对烟草白粉病的防效

蔡永占，王瑞宝，白 涛，刘有才，韩小女，王 斌，华小兵，李 诚，毛明林，字文霖

（1云南省烟草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；2宣威市农业技术推广中心，云南宣威 655400；3微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，昆明 650217；4云南省微生物发酵工程研究中心有限公司，昆明 650217）

0 引言

烟草白粉病(Erysiphe ciohoracearam)是由二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)引起的气传真菌性病害[1-2]，通常老叶先发病，主要危害时期为旺长期前后，明显症状为叶片正反面附着一层白粉。近年来，国内西南部分地区发病严重，导致烟叶烘烤困难，丧失经济价值。烟草白粉病的防治需遵循“预防为主、综合防治”的方针，当前多选取抗病品种选育[3-6]、化学药剂施用[7-11]及加强栽培管理[11]等措施防治烟草白粉病，但存在大面积推广难、抗药性强、受气候环境因素制约等问题，尤其是宣威植烟区域，品种以‘云烟87’为主，属易感白粉病品种，综合防治白粉病是一大难题。通过筛选应用有益微生物抑制烟草白粉病的发生是烟叶高质量绿色发展有效途径。大量研究[12-19]表明，有益功能微生物尤其是芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对烟草白粉病的发生及防治具有优良效果，无污染、无残留、安全高效等优点使得生物防治成为现代烟叶生产过程中最具应用前景的防治手段。笔者借鉴前人的研究方法，通过筛选对烟草白粉病具有高效防治效果的功能微生物，并制成悬浮制剂，采用叶面喷施的方法对烟草白粉病进行预防和防治，以期筛选出效果优于常用化学农药的微生物菌株，并开发成生物制剂用于烟草白粉病防治，为曲靖烟区烟叶的持续、协调、优质发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

研究田间试验于2020年4—10月在曲靖市宣威市德禄乡（海拔1835.8 m，26.464070°N、103.956701°E）进行，室内试验在云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚进行。

1.2 供试材料

供试作物为‘云烟87’。供试药剂为微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心从‘云烟87’叶片中筛选获得的对白粉病具有明显效果的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)（菌株编号分别为YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071）制得的悬浮制剂和菌悬液，25%嘧菌酯悬浮剂（江西红土地化工有限公司生产），500 g/L甲基硫菌灵悬浮剂（上海沪联生物药业技术股份有限公司）。供试器材为舜宇OD140B光学显微镜。

1.3 试验方法

1.3.1 室内防效研究

（1）供试烟草的培养。将混匀的土壤装入口径12cm、高度10 cm的黑色育苗盆中，每盆种1株烟草幼苗，待烟草长至团棵期时，用白粉孢子悬浮液均匀喷雾于烟草叶片，调整温室温度为27℃，湿度为75%，利于白粉病的发生。

（2）供试菌液的制备。将枯草芽孢杆菌分别活化后，挑取单菌落放入250 mL LB液体培养基中，在170 r/min、37℃条件下振荡培养72 h，备用。

（3）温室防效探究。待烟草叶片初现病斑时，吸取供试菌株发酵液200 mL，加入0.1 g吐温20和0.2 g黄原胶搅拌均匀制备成菌量达1.0×108CFU/mL的悬浮制剂，用清水稀释10倍喷施于叶片表面，每株叶片喷20 mL。设喷清水的植株为空白对照，25%嘧菌酯悬浮剂2000倍液为阳性对照，每个处理15株烟苗，每隔3天喷施1次，共喷施3次，并于第3次用药后7天调查最终发病情况，计算各处理所有叶片病情指数和防效[式(1)～(2)]。

（4）抑制白粉孢子萌发的研究。将枯草芽孢杆菌发酵液制备成菌量为1.0×108CFU/mL菌悬液，分别取50 μL均匀涂布到撒有白粉孢子的琼脂玻片上，25℃真菌培养箱中暗培养24 h后镜检，根据芽管长度判断白粉孢子萌发情况。

1.3.2 大田防效研究

（1）枯草芽孢杆菌不同用量对白粉病发生的影响。选取易发白粉病地块，在白粉病发病初期将供试菌发酵液制备成悬浮生防制剂，分别取50、100、150倍液喷施于发病植株叶片，同时设置喷清水的处理为空白对照，甲基硫菌灵全量喷施为阳性对照，每个处理15株烟苗，3次重复，每隔3天用药1次，连喷3次。第1次用药前调查病害，最后1次用药后3、7、10天分别调查病害，计算病情指数和防效。

（2）枯草芽孢杆菌与低毒化学农药协调使用对白粉病发生的影响。选取白粉病发病严重地块，在白粉病发病初期选取防效最优的供试菌株与低毒化学农药协调使用，全量、半量喷施甲基硫菌灵一次后，喷施不同用量悬浮制剂，同时设置单独使用生防制剂的处理、单独使用甲基硫菌灵的处理和清水对照，每个处理15株烟苗，3次重复，每隔3天用药1次，连喷3次。第1次用药前调查病害，最后1次用药后3、7、10天分别调查病害，计算病情指数和防效。

1.4 调查与统计

分级标准和防治效果计算方法参考GB/T 23222—2008。烟草白粉病病情调查分6个等级。0级—无病斑；l级—病斑面积占整个叶片面积5%以下；3级—病斑面积占整个叶片面积6%～10%；5级—病斑面积占整个叶片面积11%～20%；7级—病斑面积占整个叶片面积21%～40%；9级—病斑面积占整个叶片面积40%以上。

1.5 数据分析

采用SPSS 20.0软件进行数据的方差统计分析，多重比较采用Duncan’s新复极差法进行多组样本间的差异显著性检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对温室白粉病发生的影响

供试菌株YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071悬浮剂稀释10倍后使用，防效分别达70.49%、61.15%、69.71%（表1）。25%嘧菌酯悬浮剂较YWF-19-0068、YWF-19-0071防效不显著；同时，25%嘧菌酯悬浮剂和YWF-19-0068防效显著高于YWF-19-0070。

表1 株拮抗细菌对温室烟草白粉病的防治效果

2.2 枯草芽孢杆菌对烟草白粉孢子萌发的影响

取供试菌株YWF-19-0068、YWF-19-0070和YWF-19-0071的菌悬液，平板计数法测定有效活菌数分别为8.40×108、5.7×108、7.90×108CFU/mL，将菌量调至1.0×108CFU/mL，分别将其稀释为50、100、150倍3种浓度的菌悬液，取50 μL均匀涂布到撒有白粉孢子的琼脂玻片上，在25℃真菌培养箱中暗培养24 h后镜检结果表明，3株生防菌对烟草白粉孢子萌发均具有良好的抑制效果，随着稀释倍数的增加，抑制率逐渐降低（表2）。50倍液时抑制率分别为56.92%、56.92%、58.46%，100倍液时抑制率分别为41.54%、35.38%、33.85%，150倍液时抑制率分别为30.77%、24.62%、23.08%。

表2 生防菌抑制烟草白粉孢子萌发结果统计

2.3 枯草芽孢杆菌对大田白粉病发生的影响

以甲基硫菌灵全量喷施作为阳性对照，使用枯草芽孢杆菌悬浮制剂3次后，调查烟株白粉病发病情况。表3的结果表明，最后一次用药3天后，悬浮菌液的防效随稀释倍数增加而降低，50倍液处理防效由高到低依次为 YWF-19-0068、YWF-19-0071、YWF-19-0070；100倍液处理和150倍液处理的防效由高到低均为YWF-19-0070、YWF-19-0068、YWF-19-0071。最后一次用药7天后，菌悬浮剂的防效均大幅提升，随稀释倍数的增加，YWF-19-0068悬浮剂防效依次为54.10%、43.72%、40.13%；YWF-19-0070悬浮剂防效依次为65.98%、62.04%、56.34%；YWF-19-0071悬浮剂防效依次为57.05%、41.88%、40.18%。最后一次用药10天后，YWF-19-0068悬浮剂50倍液处理防效降至46.85%；100倍液处理防效降至43.48%；150倍液处理防效降至38.02%。YWF-19-0070悬浮剂50倍液处理防效达65.50%；100倍液处理防效达65.23%；150倍液处理防效降至52.79%。YWF-19-0071悬浮剂用药10天后防效均有所下降，50倍液、100倍液、150倍液防效依次为51.70%、39.83%、36.09%。整体而言，3株枯草芽孢杆菌对烟株白粉病均具有良好的防效，用药3次后防效与全量甲基硫菌灵相当，甚至更优，但从持效期及使用成本看，YWF-19-0070更适合用于烟株白粉病的生物防治。

表3 烟草白粉病大田防治剂量对烤烟白粉病发生的影响

2.4 枯草芽孢杆菌与低毒化学农药协调使用对烤烟白粉病发生的影响

选取YWF-19-0070悬浮剂与低毒化学农药甲基硫菌灵协调使用。表4的结果表明，单独使用YWF-19-0070悬浮剂时，随着用药后天数的增加，白粉病的防效呈现增强的趋势，用药10天后防效依然高于单独使用甲基硫菌灵的处理。先喷施一次全量甲基硫菌灵后，每隔3天喷施一次枯草芽孢杆菌悬浮剂，用药10天后，50倍液、100倍液、150倍液防效分别为83.06%、84.91%、77.73%，远高于甲基硫菌灵全量喷施处理。甲基硫菌灵半量喷施一次后，每隔3天喷施1次生防制剂，用药10天后，随着稀释倍数的增加，防效分别达75.01%、60.23%、72.13%，除100倍液处理低于半量甲基硫菌灵防效外，其余均高于甲基硫菌灵处理的防效。整体而言，使用甲基硫菌灵与否，对烟草白粉病的防治并无显著促进作用，反而喷施菌悬浮剂的处理防效远胜于使用甲基硫菌灵处理。

表4 枯草芽孢杆菌与低毒化学农药协调使用对烤烟白粉病的影响

3 结论

（1）本研究的3株枯草芽孢杆菌菌悬液处理后的白粉孢子镜检结果表现为不萌发或萌发率较低，已萌发孢子的芽管出现畸形，扭曲成念珠状，胞质外流，或顶端膨大，不能发育成正常的菌丝体，这一结果与前人[7,10,20-22]的研究结果一致。

（2）3株枯草芽孢杆菌YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071发酵液制备的悬浮剂对烟草室内防效分别达70.49%、61.15%、69.71%。菌株YWF-19-0070悬浮剂的大田防效远优于甲基硫菌灵。同时，菌株YWF-19-0070悬浮剂与甲基硫菌灵协调使用在一定程度上可以提升对烟草白粉病的防效，但不同稀释倍数下的持效期不如YWF-19-0070悬浮剂稳定，可能与该菌株产生的代谢产物等抑菌功能物质的数量多、活性强有关系。

（3）芽孢杆菌作为有益微生物与病原真菌的拮抗机制广泛存在，芽孢杆菌在促进烟株生长与防病方面发挥着重要作用，这除与有益微生物分泌生长激素有关外，还与能诱导烟株产生抑菌物质及提高相关防御酶活性，进而增强系统抗性有关[23-28]。

4 讨论

枯草芽孢杆菌类有益微生物对于作物真菌性病害的防治具有优良效果。本研究单独使用生防制剂的研究结果与前人研究结果一致，但证实功能性代谢产物的数量及活性对于烟草白粉病的防治更具有指导意义与研究价值。同时，枯草芽孢杆菌对于增强烟株地下部长势，丰富土壤有益功能微生物同样功不可没，关于根施微生物菌剂增强作物抗病性的研究较多，但关于其与叶部病害减轻的机理揭示研究较少。笔者在此大胆设想，是否可以通过根施功能性生防菌剂结合叶面喷施对白粉病具有优良防效的生防制剂，来实现烟草真菌性病害真正意义上的生物防治，但此设想还需进一步研究及论证。本研究中的菌株YWF-19-0070作为烟草白粉病叶面喷施的潜力菌株，制备成悬浮剂后对白粉病的抑制效果明显，持效期稳定，可作为烟草生产过程中白粉病生物防治的生防产品广泛应用。