涝渍胁迫下辣椒叶绿素含量与SPAD值相关性模型建立及应用

宋 钊，梁栌丹，黄文茵，陈 潇，曹 健，何裕志，张白鸽

（广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640）

0 引言

叶绿素含量是衡量作物营养状况的重要指标。测定叶绿素含量的常规方法是通过丙酮或者乙醇提取，然后使用分光光度计测定叶绿素含量。由于涉及到取样、测定、分析，费时费力，在应用上受到一定的限制。随着科技与工艺水平的不断提高，叶绿素无损检测技术得到长足发展，便携式叶绿素仪(SPAD)是其中的佼佼者。日本MINOLTA公司推出的SPAD-502叶绿素手持光谱仪，可在田间无损测定植物叶片的叶绿素相对含量[1]，其原理是2个发光二极管向叶片的某个部位发射红光和红外光，利用2个波长下光密度差别测量叶绿素相对含量[2]。使用时不破坏植物组织，不受时间、气候限制，方便轻巧，测定的SPAD值与叶片的叶绿素含量具有良好的一致性[2-3]，并可预估作物产量指标[4]，近年来被科研工作者广泛应用[5-6]。目前，该叶绿素仪已经成功应用于水稻、棉花、玉米[3]、莴苣[1]、番茄[2]、马铃薯[4]及辣椒[6]等作物的叶绿素无损检测研究中。SPAD值被用来评价辣椒苗期的耐寒性[7-9]、耐弱光性[10-11]和耐涝性[6]，研究不同施氮水平下[5,12-15]，不同生长调节剂[16-17]、基质配比[18]对辣椒幼苗叶绿素含量变化的影响，但对辣椒叶绿素实测含量与SPAD值相关性及涝渍胁迫对这种相关性影响的研究仍未见报道。

此前，笔者团队建立了辣椒形态学涝渍胁迫评价体系，并应用SPAD值评估辣椒在涝渍胁迫下叶片叶绿素含量变化[6,19]，发现20个辣椒品种胁迫6、9天后叶绿素SPAD值都低于胁迫3天与对照，并且涝渍胁迫3天后叶绿素含量最高。但是当时并没有使用化学方法测定叶绿素含量，常规管理及涝渍胁迫下SPAD值能否真实反映辣椒叶片叶绿素含量仍需进一步研究。本研究使用叶绿素仪测定SPAD值之后利用分光光度计法测定叶绿素含量，对辣椒叶片受到短期（每2 h）及长期（每3天）涝渍胁迫后叶绿素含量变化进行研究，以期为快速测定辣椒叶绿素含量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒品种为广东省农业科学院蔬菜研究所选育的‘粤红3号’美人椒、‘汇丰二号’牛角椒，及广州市绿霸种苗有限公司选育的‘甜冠107’甜椒、‘绿霸星12号’线椒和‘经典翠宝’泡椒，均为辣椒属一年生种(Capsicum annuum)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 2020年9月9日在广东省农业科学院蔬菜研究所大丰基地种植5个试验材料，试验分胁迫组和对照组，每个品种每个处理3次重复。11月11日将胁迫组中四叶一心期长势一致幼苗按照宋钊等[6]的方法进行胁迫处理，对照组植株进行正常水分管理。

1.2.2SPAD值的测定 使用日本柯尼卡美能达公司(Konica Minolta)的SPAD-502 PLUS叶绿素荧光仪对叶片叶绿素含量进行测定，该仪器通过测量叶片对2个波长段里的吸收率来评估叶绿素相对含量，用SPAD值表示。在胁迫处理3、6、9天后测量SPAD值；在胁迫处理2、7天时，8:00—18:00每2 h测量1次SPAD值。测定SPAD值后取对应叶片放入液氮盒中保存。

1.2.3 叶绿素的测定 参考张宪政[20]的方法测定叶绿素含量。称取0.2～0.3 g叶片，去除粗大的中心叶脉后剪成碎片，放入离心管中，用10 mL提取液（丙酮:无水乙醇=1:1）避光浸泡1天，取上清液，用全波长酶标仪测定663、645 nm下的吸光度，分别计算叶绿素a、叶绿素b含量及总叶绿素含量，如式(1)～(3)。

式中，叶绿素含量单位为mg/g，D663、D645分别为相应波长下的光密度值，V为提取液的体积，W为叶片鲜重。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据统计、相关性分析及趋势作图。直线相关分析分别采用了指数、线性、对数、乘幂等函数。作图类型为散点图，横坐标SPAD值以35或40为起点。

2 结果与分析

2.1 涝渍胁迫对辣椒叶片叶绿素含量的影响

为了探明SPAD仪是否适用测量辣椒叶片叶绿素含量变化，对具有一定代表性的5个类型辣椒品种叶片叶绿素含量进行了SPAD仪和化学方法测定，并对正常管理及涝渍胁迫3、6、9天后叶片叶绿素含量变化与SPAD值进行相关性分析。5个品种的指数、线性、乘幂及对数模型方程、相应的决定系数(R2)和相关系数(r)均列于表1。对相关性模型的拟合程度进行显著性检验，并将对照组及胁迫组各品种的最优相关模型及回归趋势作图（图1）。如图1A所示，‘粤红3号’和‘汇丰二号’的最优模型是线性相关，‘经典翠宝’是指数方程。从品种相关性看，这3个品种的相关系数排在前三，‘经典翠宝’相关系数最高，而‘绿霸星12号’和‘甜冠107’最优相关模型决定系数不到0.2，SPAD值与叶绿素含量相关性较差。在对照组中，5个品种的叶绿素含量与SPAD值呈正相关，趋势一致。

表1 辣椒叶片叶绿素含量与SPAD值相关性分析（每3天）

图1 5个辣椒品种每3天叶绿素含量变化趋势图

涝渍胁迫后相关性变化趋势如图1B所示。‘粤红3号’和‘绿霸星12号’最优相关模型为乘幂方程，仅‘粤红3号’、‘汇丰二号’和‘绿霸星12号’的叶绿素含量与SPAD值呈正相关，但‘汇丰二号’相关性较差(R2=0.017)。而‘经典翠宝’和‘甜冠107’的4个相关模型均为负相关。

2.2 ‘粤红3号’和‘汇丰二号’叶绿素含量日变化分析

在胁迫处理3、6、9天后，分别用叶绿素荧光仪和化学方法测定叶绿素含量，结果显示无论是在对照组还是在胁迫组，SPAD值均能反映‘粤红3号’和‘汇丰二号’叶片中叶绿素含量变化趋势。为调查胁迫后短期内叶绿素含量变化，笔者在涝渍胁迫后第2、7天8:00—18:00，每2 h测量一次SPAD值并用化学方法测定相应叶片的叶绿素含量，其相关分析结果列于表2及图2中。‘粤红3号’在对照组中最优模型是指数方程，在胁迫组中为线性方程，相关系数均高于对照组（图2A）。‘汇丰二号’在对照组中的最优模型为线性方程(y=0.0966x-2.661)，线性相关趋势非常明显(r=0.945)，并且4个拟合方程的相关系数达极显著水平，表明SPAD值对叶片叶绿素含量的模拟相关程度极高，但在胁迫组中决定系数不到0.3（图2B）。‘粤红3号’4个拟合方程决定系数在涝渍胁迫后明显增加，而‘汇丰二号’涝渍胁迫之后全部急剧下降。

表2 辣椒叶片叶绿素含量与SPAD值相关性分析（每2 h）

图2 ‘粤红3号’和‘汇丰二号’每2 h叶绿素含量变化

‘粤红3号’和‘汇丰二号’在胁迫2、7天后的单日叶绿素含量进行了相关性比较分析，以探究涝渍胁迫时长是否对相关性的影响。从表3可见，胁迫7天后，‘粤红3号’胁迫组和‘汇丰二号’对照组所有模拟方程的相关系数均达显著水平。胁迫2天后，‘粤红3号’对照组回归趋势线位于胁迫组上方，对照组中平均叶绿素含量(2.03 mg/g)高于胁迫组(1.79 mg/g)，但是对照组和胁迫组中大部分拟合模型的相关系数均极低且为负（图3）。而在胁迫7天后，胁迫组中叶绿素含量和SPAD值最优拟合模型为线性方程(R2=0.7918)，且4个方程的相关系数均达显著水平。

表3 胁迫2、7天时辣椒叶片叶绿素含量与SPAD值相关性分析（每2 h）

图3 ‘粤红3号’在胁迫2、7天后每2 h叶绿素含量变化

胁迫2天后，‘汇丰二号’胁迫组中叶绿素含量和SPAD值最优拟合模型为指数函数(R2=0.4585)，而对照最优模型则为线性方程(R2=0.2684)。胁迫7天后，胁迫组最优模型的决定系数降为0.1279，而对照组则升为0.676。从图4可见，胁迫2天后胁迫组回归趋势线位于对照组上方，短期胁迫造成‘汇丰二号’叶片叶绿素含量增加（图4A）；而在胁迫7天后，趋势线与对照组交换位置，胁迫组叶绿素平均含量从1.78 mg/g增加到2.23 mg/g，而对照组叶绿素含量则均从1.35 mg/g增加到2.54 mg/g，长期涝渍胁迫抑制了‘汇丰二号’叶片中叶绿素的合成（图4B）。

图4 ‘汇丰二号’在胁迫2、7天后每2 h叶绿素含量变化

2.3 SPAD值与叶绿素a、叶绿素b相关性分析

对照组中‘经典翠宝’（表1）和‘汇丰二号’（表2）4个拟合模型相关系数均达极显著水平，以这2个品种为对象，研究SPAD值与叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量的相关关系。‘经典翠宝’中SPAD值与叶绿素a及总叶绿素的最优拟合模型为指数方程，相关系数均达极显著水平，而与叶绿素b相关性较低（图5A）。‘汇丰二号’中SPAD值与叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量最优拟合模型为线性方程。可见，在相关系数较高的回归方程中，2个品种最优模拟模型并不一致。

图5 SPAD值与叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量变化

2.4 ‘汇丰二号’最优拟合模型检验

在辣椒叶片叶绿素含量与SPAD值相关性分析中，筛选到‘汇丰二号’最优拟合模型为线性方程(y=0.0736x-1.7983)，相关系数达到极显著水平，其中x代表SPAD值，y代表叶绿素含量。为了检验该模型的可靠性，使用涝渍胁迫7天时‘汇丰二号’SPAD值与叶绿素实测值对模型进行检验，将SPAD值代入模型得到理论计算值，理论值和实测值拟合曲线如图6所示。为了检测叶绿素含量理论值与实测值的吻合程度，计算均方根误差RMSE=0.36，均方根误差小于1说明模型的理论值和实测值差异不显著，该模型可靠。

图6 ‘汇丰二号’叶绿素含量与SPAD拟合模型检验

3 讨论

SPAD仪通过测量叶片2个波长段里的吸收率并换算成SPAD值来评估叶绿素相对含量[1]。SPAD值与作物叶片中叶绿素含量呈正相关关系，SPAD值越大，叶绿素含量越高，在多个作物中[2-4,21]已经验证能真实反映叶绿素含量变化并用来评价作物营养状况，从而实现作物生长情况的快速诊断。不同作物，甚至相同作物不同品种间SPAD值与叶片叶绿素含量的拟合相关程度存在差异。辣椒类型丰富，品种多样，仅Capsicum annuum一个栽培种从果实类型来分就存在扁灯笼形、方灯笼形、长灯笼形、短锥形、长锥形、短牛角形、长牛角形、短羊角形、长羊角形、短指形、长指形、线性、圆球形等10余个变种类型[22]，然而辣椒叶片叶绿素含量与SPAD值相关性关系研究鲜见报道。本研究选取具备一定代表性的5种类型辣椒品种，研究正常管理及涝渍胁迫下，辣椒叶绿素含量与SPAD值之间的相关性关系。

3.1 不同辣椒品种间叶片叶绿素含量与SPAD值相关性差异较大

从对照组中5个品种相关性分析结果看，各类型辣椒品种的叶绿素含量与SPAD值相关性均为正相关，且各品种回归趋势线一致性较好，表明SPAD值能够代表辣椒叶片中叶绿素含量的变化，即SPAD值越大，叶绿素含量越高。但是各品种间SPAD值与叶绿素含量的相关性存在较大差异，最高的‘经典翠宝’相关系数达到0.832，而‘绿霸星12号’仅为0.244。从最优拟合模型来看，线性方程能更好模拟SPAD值与叶绿素含量的相关性关系，‘粤红3号’、‘汇丰二号’和‘绿霸星12号’最优拟合模型均为线性方程。从品种看，‘粤红3号’、‘汇丰二号’和‘经典翠宝’最优拟合模型的相关系数较高，SPAD值能准确反映叶片中叶绿素含量，而‘绿霸星12号’和‘甜冠107’中最优模型的决定系数均不到0.2，相关性较差。而从拟合优度指数看，‘经典翠宝’的模型拟合最佳，各模型的相关系数均达极显著水平；次之为‘汇丰二号’，全部达到显著水平；之后为‘粤红3号’，其线性模型和对数模型的相关系数达到显著水平；而‘绿霸星12号’和‘甜冠107’4个模型方程的拟合程度均未达显著水平。可见，SPAD值虽能反映辣椒叶片中叶绿素含量变化趋势，但是品种间差异较大，在本研究中SPAD评价叶绿素含量准确性从高到低依次排序为‘经典翠宝’、‘汇丰二号’、‘粤红3号’、‘甜冠107’及‘绿霸星12号’。

3.2 涝渍胁迫严重干扰了叶绿素荧光仪对辣椒叶片叶绿素含量的测量

涝渍胁迫后，‘甜冠107’和‘经典翠宝’中SPAD值与叶绿素含量相关系数大幅减小，且反转呈负相关（图1B），即SPAD值越大，叶绿素含量反而越低。‘汇丰二号’胁迫处理后4个拟合模型的决定系数均大幅下降，但是这种变化趋势的方向未变，仍为正相关，但涝渍胁迫对SPAD测量‘汇丰二号’叶绿素含量的准确度影响明显。而‘粤红3号’对照组和胁迫组最优拟合模型的相关系数均接近0.7，涝渍胁迫前后拟合程度变化幅度较小，对SPAD准确度影响较小。值得注意的是，‘绿霸星12号’胁迫处理后最优模型的相关系数(r=0.668)达显著水平，而对照组最优模型仅为0.312，并且4个拟合方程的相关系数均比对照组增加近1倍，即SPAD值更能代表胁迫后叶片叶绿素含量，而非正常管理条件下叶片叶绿素含量。综上所述，涝渍胁迫情况下，SPAD不适宜用来测量‘汇丰二号’、‘甜冠107’和‘经典翠宝’的叶绿素含量，而能较为准确地拟合‘粤红3号’和‘绿霸星12号’中叶绿素含量，品种间差异明显。

3.3 不同辣椒品种对短期和长期涝渍胁迫的耐受性迥异

在叶绿素日变化研究中，‘粤红3号’对照组回归趋势线位于胁迫组上方，且对照组的SPAD值和叶绿素含量平均值均高于胁迫组，表明‘粤红3号’在受到涝渍胁迫后叶绿素含量受到明显影响。进一步研究发现，胁迫2天后，虽然SPAD值在增加，但实际叶绿素含量并无明显变化（图3A），相关系数(0.04)远低于对照(0.178)，说明涝渍胁迫2天后即严重影响SPAD值与叶绿素含量的相关性，类似于干旱胁迫后叶片蜡质层增厚[23]，作物受到涝渍胁迫后迅速启动应激机制通过调整呼吸速率[24]、叶片结构来适应涝渍胁迫环境[6]，从而影响了SPAD值的测量准确度。而在胁迫7天之后，植物体内各种反应趋于稳定，叶绿素含量与SPAD值一致性增加，最优模型的相关系数达到0.89，并且所有4个拟合方程的r值达极显著水平。从图2B可见，‘汇丰二号’对照组和胁迫组的回归趋势线几乎完全重叠，说明涝渍胁迫并没有对SPAD值与叶绿素含量相关性造成严重干扰，呈明显线性相关关系。在胁迫2天后，胁迫组最优拟合模型相关系数达到0.677，远高于对照组的0.518，而在胁迫7天后，胁迫组的最优模型相关系数降为0.358，此时对照组所有相关系数均达显著水平（表3）。综上所述，短期涝渍胁迫对‘粤红3号’叶绿素含量与SPAD值的相关性产生严重影响，而对‘汇丰二号’辣椒影响很小。SPAD值能真实反映‘汇丰二号’辣椒叶片中叶绿素含量变化，但长期涝渍胁迫仍然对相关性造成较大负面影响。

4 结论与展望

本研究对美人椒、牛角椒、甜椒、线椒和泡椒5种类型辣椒SPAD值与叶绿素含量相关性进行了研究，在正常管理条件下，SPAD值与各种类型辣椒叶片叶绿素含量呈正相关关系，能真实评价辣椒叶片叶绿素含量，与在玉米[3]、莴苣[1]、番茄[2]及马铃薯[4]等作物中取得的结果一致。进一步研究表明，‘经典翠宝’和‘汇丰二号’中SPAD值与叶绿素a及总叶绿素含量呈极显著正相关关系，而与叶绿素b相关性较低，这与SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素含量的固定波长660 nm与叶绿素a的吸收峰663 nm非常接近有关。证实涝渍胁迫严重干扰了SPAD仪准确评价辣椒叶片叶绿素含量，短期胁迫与长期胁迫对不同品种的干扰程度不同。本研究建立了正常管理及涝渍胁迫条件下辣椒SPAD值与叶绿素含量最优相关性数学函数，经检验相关系数达显著水平的拟合模型可直接应用到相关研究中，测量SPAD值代入方程即可快速获取叶绿素含量，实现了对辣椒叶绿素含量的快速无损检测，避免了传统化学方法测定中取样、碎样、浸提、上机等繁杂工作，为以后研究中辣椒叶绿素的快速测量提供了参考。

叶绿素含量无损检测至关重要，后续研究将对初步建立的模型进一步进行优化和验证。结合涝渍胁迫下株高、根长、植株鲜重、干重等形态特征指标，和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶及丙二醛等生理生化指标对辣椒品种耐涝性进行综合评价。利用辣椒涝渍胁迫评价体系[19]和本研究建立的叶绿素含量与SPAD值相关性模型筛选高耐涝渍和涝渍敏感的自交系材料，构建遗传群体对相关控制基因进行遗传定位，为培育耐涝性较强的辣椒新品种夯实基础。