5 岁孤独症谱系障碍儿童唾液菌群宏基因组学分析

卢绪英 方芳 李然 滕飞 公文 张进 滕娜娜 辛秉昌 孙德刚

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)作为一类与遗传高度相关的神经发育障碍疾病，其三大核心特征是：交互性社交互动障碍、交流障碍、重复性的活动和狭隘的兴趣，最早可于2 岁出现症状[1-2]。男女比例在2∶1～4∶1，全球发病率为1%[3]。目前没有这种复杂的精神类疾病的根治疗法，对社会保障、教育、医疗系统构成了严重的挑战。而诊断只能依赖专业人员的临床观察和家长访谈，没有客观的医学诊断标志。研究证实口腔菌群与肠道菌群在抑郁症、多发性硬化症、阿尔兹海默症和自闭症等中枢神经系统疾病的发生发展中发挥重要的作用[4-7]。ASD患者因运动协调性缺陷，难以完成自主清洁，口腔卫生情况差[8]。在人类微生物组计划中，近一半(45%)的受试者的口腔细菌和粪便细菌重叠[9]。口腔细菌的持续定植可使肠道微生物群失调和慢性炎症永久化[10]。口腔菌群可能通过单独作用或与肠道菌群交互作用等形式参与了ASD的发病机制。传统的微生物鉴别方法(微生物培养、PCR扩增)难以研究整个环境样本微生物群。为获取更真实的生物学信息，近年来环境样本微生物的研究多采用高通量测序技术，关于口腔菌群与ASD关系的研究较少且多采用二代测序[11-12]。由于测序长度的限制，二代测序仅能选择16S rRNA部分可变区作为扩增片段(V1-V3/V3-V4/V5-V6/V4)，而以SMRT为代表的三代测序技术可读取基因全长，提高物种鉴定水平的的同时，在复杂环境群类区分中具有显著优势[13]。

本研究首次应用三代测序分析ASD患者口腔菌群，探究其与神经系统发育正常者的唾液菌群差异，为将来寻找孤独症谱系障碍唾液标志物提供研究资料。

1 资料与方法

1.1 样品采集

1.1.1 采样对象的选择 筛选出30 例孤独症谱系障碍儿童(ASD组)，年龄均在5 岁左右(男∶女=5∶1)。孤独症谱系障碍均符合《精神障碍诊断与统计手册(第5版)》诊断标准。筛选出30 例神经发育正常儿童(H组)，年龄均在5 岁左右(男∶女=17∶13)。经与班主任访谈全部为神经精神发育正常儿童。排除标准：在过去3 个月内使用抗生素或免疫抑制药物；口腔软硬组织有明显异常；有发育畸形；全身系统性疾病的神经发育正常儿童。儿童监护人知情同意并签署知情同意书，研究经青岛大学附属青岛市口腔医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 样品采集 唾液收集：采样根据《人类微生物组计划程序手册》(http://hmpacc.org/resources/tools_protocols.php)和之前的研究对2 名口腔医生进行样本采集培训。Kappa值>0.85，上午9 时收集样本，所有受试者早晨不刷牙，采样前2 h内不进食并轻漱口，用3 mL无菌EP管收集3 mL非刺激性唾液，标记后于-4 ℃条件保存，2 h内保存到-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取纯化、16S rRNA基因扩增及测序

使用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit(QIAGEN)试剂盒纯化分离唾液样本中基因组DNA，对其16S rRNA 片段全长进行基因扩增，使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready mix试剂盒进行PCR扩增，利用PacBio测序平台进行SMRT测序。

1.3 生物信息学和统计学分析

使用USEARCH(version 10.0)进行生物信息学分析。使用QIIME及R语言进行菌群统计分析(P<0.05即差异有统计学意义)。H组和C组之间多样性及代谢差异的比较采用Studentt检验。通过LEfSe统计分析不同分组中的物种组成差异。运用ROC曲线及曲线下面积(AUC)进行可视化分类准确性分析。

2 结 果

2.1 α多样性分析

图1可见：多样性指数中，ACE、Chao1和PD指数显示H组显著高于ASD组(P<0.05)，说明ASD患儿的唾液菌群多样性较正常儿童下降。

图1 受试者唾液菌群多样性分析

2.2 β多样性分析

图2可见：bray-curtis算法表明，ASD组和H组之间的唾液菌群的β多样性物种差异显著(P<0.05)，各样本的群落构成存在差异，但样本有根据病理状态聚类的趋势。

图2 H组和C组唾液微生物群落结构比较

2.3 差异性代表菌分析

在门水平，ASD患者和健康对照组的唾液菌群主要包括Firmicutes(厚壁菌门)，Proteobacteria(变形菌门)，Bacteroidetes(拟杆菌门)，Actinobacteria(放线菌门)，Fusobacteria(梭杆菌门)，其中Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门)在菌群结构比例中占大多数，分别占81.5%(ASD组)和78.5%(H组)，是绝对的优势菌群(图3)。

图3 ASD 组和H组唾液微生物群落物种构成比较

根据LDA score>4的筛选标准(图4)，在ASD组中：门水平差异菌为Proteobacteria(变形菌门)；属水平差异菌为Haemophilus(嗜血杆菌属)和Neisseria(奈瑟菌属)；种水平差异菌为uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟菌种)。在H组中：门水平差异菌为Firmicutes(厚壁菌门)；属水平差异菌为Streptococcus(链球菌属)和Prevotella(普雷沃氏菌属)；种水平差异菌为Streptococcus_salivarius(唾液链球菌种)和Streptococcus_sanguinis(血链球菌种)。

图4 ASD组和H组唾液菌群差异菌

2.4 菌群功能及代谢通路分析

基于KEGG代谢通路预测唾液菌群功能特征，结果显示两样品组的功能宏基因组存在显著差异，这可能表明ASD疾病状态下口腔微生物宏基因功能发生了巨大变化。与健康对照组相比，ASD组糖类代谢通路、翻译、转录显著下调(P<0.05)，而能量代谢通路、脂质代谢通路和氨基酸代谢通路显著上调(P<0.05)(图5)。

图5 ASD组和H组唾液菌群代谢差异的比较

2.5 基于唾液微生物建立ASD评估模型

首先，筛选对建模最优的种系发育水平，发现利用细菌种水平图谱可获得性能最佳模型(AUC=80.6%，图6)，提示唾液链球菌、血链球菌和未命名的奈瑟菌在孤独症谱系障碍风险评估方面具有潜在的应用价值。

图6 利用唾液菌群图谱建立孤独症谱系障碍分类模型

3 讨 论

研究发现口腔微生态失调与阿尔茨海默病、帕金森和自闭症等神经系统疾病相关。为寻找疾病可能的早期诊断标志，口腔微生物群落日益得到重视[14]。在本研究中，ASD儿童唾液微生物多样性和丰富度降低，与之前研究结果部分一致[11-12,15]。这可能与地理、种族和测序技术等不同有关。

在本研究中，ASD儿童中Proteobacteria(变形菌门)增加，Firmicutes(厚壁菌门)降低。此外，在ASD儿童唾液中观察到Gammaproteobacteria(丙型变形菌纲)、Pasteurellales(巴斯德氏菌目)、Betaproteobacteriales(β-变形菌纲)、Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Pasteurellaceae(巴斯德氏菌科)、Neisseriaceae(奈瑟氏菌科)、Haemophilus(嗜血杆菌属)、Neisseria(奈瑟氏菌属)和uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟氏菌种)的丰度增加，以及Streptococcus(链球菌属)、Prevotella(普雷沃氏菌属)、Streptococcus_salivarius(唾液链球菌种)和Streptococcus_sanguinis(血链球菌种)的含量减少。这些观察结果可能有助于确定疾病的口腔微生态失衡特征。以种水平3 种差异菌建立的评估模型准确率达80.6%。Haemophilus(嗜血杆菌属)和Streptococcus_salivarius(唾液链球菌种)的类似趋势得到先前研究研究结果的支持[12,15]。Haemophilus(嗜血杆菌属)常在免疫功能低下的的人群中检出[16]。Streptococcus_salivarius(唾液链球菌种)因其能够抑制IL-6和IL-8等炎性因子的活化，而作为安全有效的口腔益生菌得到广泛应用[17]。本研究中ASD儿童口腔微生物群落结构及代谢特征的改变，得到先前的ASD儿童肠道微生物改变的支持[18]。

一方面，在肠道菌群中，ASD儿童中的Firmicutes(厚壁菌门)、Prevotella(普雷沃氏菌属)丰富明显降低。Prevotella(普雷沃氏菌属)在参与糖类代谢和纤维素代谢途径中发挥关键作用，碳水化合物消化障碍是ASD患者的病理机制，同时ASD儿童普遍拒绝果蔬类而更偏爱高脂肪类食物[19]，本研究结果中的ASD儿童唾液菌群糖类代谢功能减退。因此富含纤维素的食物摄入减少及Firmicutes(厚壁菌门)和Prevotella(普雷沃氏菌属)丰度减少，可能与ASD儿童胃肠道功能紊乱有关。ASD人群对感觉的处理主要分为3 种模式：感觉超敏、感觉低敏和感觉寻求。当果糖不能被正常吸收时，会严重干扰色氨酸(TRP)的吸收，TRP作为合成神经递质血清素的重要原料，参与调解情绪敏感性[20]。因此，本研究结果中的ASD儿童唾液菌群氨基酸代谢异常可能与感觉处理异常有关。脂质在神经元迁移、分化、形态发生、髓鞘形成和突触可塑性等神经发育过程中具有关键作用。El-Ansary等[21]发现二磷酸代谢、胆固醇代谢、磷脂代谢和脂质转运蛋白在ASD病理条件下受损，与本研究ASD儿童唾液菌群脂质代谢功能增强的结果相反；推测这可能是菌群对人体脂质代谢失衡的代偿反应。另一方面，临床研究发现，高脂低碳水以及适量蛋白质的生酮饮食可以明显减轻自闭症典型症状[19]，其可能通过改善能量代谢、调节神经递质和消化道微生物菌群结构来介导。因此，在ASD病理状态下，患者不仅发生营养物质代谢异常、肠道菌群结构及代谢改变，同时伴随唾液菌群结构及代谢改变，间接或直接影响患者神经系统。

综上所述，在孤独症谱系障碍儿童唾液微生物群落特征存在显著改变，同时筛查出的种水平差异菌建立的评估模型，其辨别准确率可达80.6%。利用其建立ASD风险评估方案是否可以应用与临床预测高危人群，亟待进一步研究验证，由于本研究的样本量、采样位点较少，今后可加大样本采集量、增加采样生态位点，联合多组学全面精确的研究孤独症谱系障碍患者口腔微生物信息。