梅毒螺旋体TP17 蛋白B 细胞表位研究

刘晶晶，陈玉梅，潘卫东

（1.郑州大学基础医学院，郑州 450001；2.西华县人民医院检验科，周口 466000；3.郑州大学生命科学学院，郑州 450001）

TP 基因组全长1 138 006 bp，含1 041 个开放阅读框，毒力因子包括12 个膜蛋白家族和一些溶血素[6]。膜蛋白是TP 的主要抗原蛋白，对TP 的免疫学诊断和疫苗研究具有重要意义，主要包括TP47（TP0574）、TP15（TP0171）、TP17（TP0435）、TP34（TP0971）及GlpQ（TP0257）等[7]。TP47（TP0574）是第一个被证明是脂质修饰的TP 膜蛋白，是一种青霉素结合蛋白[8]。TP17 蛋白位于TP 细胞外膜，是一种分子量为16.5 kD 的膜脂蛋白，约占TP 可溶性蛋白的2%，具有较强的免疫原性[9-10]。有研究显示，以TP17蛋白为抗原的免疫学诊断试剂敏感性可以达到98%，特异性达到99%，在梅毒感染的血清学诊断中具有重要的价值[11-12]。TP17 蛋白是梅毒的主要抗原蛋白，关于TP17 蛋白抗原表位的研究报道较少，确定TP17 蛋白B 细胞表位，对TP 的免疫学诊断和疫苗设计具有重要意义。本研究提出通过生物信息学技术对TP17 蛋白的结构、免疫学特征和B 细胞表位等进行预测，建立TP17 多肽的酶联免疫吸附实验（ELISA）检测法，评价多肽与临床TP 阳性血清的反应性，验证TP17 蛋白抗原B 细胞表位预测的准确性及表位多肽用于梅毒临床检验的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验材料 梅毒阳性病例血清样品10 份（西华县人民医院），梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒-酶联免疫法（厦门英科新创公司），重组TP17 蛋白（中国近岸生物公司），TP17 多肽（委托上海生工公司合成），HRP 标记的羊抗人IgG（英国Abcam 公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 TP17 蛋白生物学特征分析 从美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）蛋白质数据库中获得TP17 蛋白的氨基酸序列（Genebank No.ADR64315.1），以SignalP-5.0 及TMHMM Server v.2.0 软件预测蛋白信号肽及跨膜区氨基酸序列；利用NetNGlyc-1.0、NetOGlyc 4.0 预测TP17 蛋白N 型和O 型糖基化位点；利用ExPASy 数据库预测蛋白分子量和等电点，见表1。

1.2.2 TP17 蛋白线性 B 细胞表位预测用DNASTAR 的Protean 软件及在线预测软件SOPMA 预测TP17 蛋白的二级结构（Secondary structure），分析α螺旋、β 折叠、转角及无规卷曲等二级结构元件的分布情况[13-14]。综合利用IEDB 数据库B 细胞表位相关分析软件（BepiPred-2.0、BepiPred 等）、SOPMA 以及DNASTAR 等软件对TP17 蛋白进行系统性分析，预测其抗原性（antigenicity）、表面可及性（accessibility）、可塑性（flexibility）、亲水性（hydrophilicity）等特征，预测线性B 细胞表位[15-16]。采用SWISS-MODEL同源建模分析TP17 蛋白的三维结构及B 细胞表位在三维结构中的定位，结合IEDB 数据库Disco-Tope：Structure-based Antibody Prediction 软件分析TP17 蛋白的构象型B 细胞表位[17]，见表1。

表1 生物信息学数据库及分析工具Tab 1 Bioinformatics database and analysis tools

1.2.3 TP17 重叠多肽的分段合成 将TP17 蛋白分成6 段（Tp17-1～Tp17-6），临近两条多肽之间设置10 个氨基酸的重复（表2）。委托上海生工公司合成多肽小分子并进行HPLC-MS 鉴定。

表2 T17 蛋白重叠多肽氨基酸序列Tab 2 Amino acid sequence of overlapping polypeptide of T17 protein

1.2.4 TP17 重叠多肽的耦联 参考文献[19]方法，采用碳二亚胺法（EDC）分别将6 段多肽与BSA 耦联，制备包被抗原，采用SDS-PAGE 鉴定多肽耦联效果。

1.2.5 TP17 蛋白抗原性检测 采用ELSIA 测定TP17 蛋白的抗原性。以碳酸盐缓冲液（CBS，PH 9.0）稀释TP17 蛋白至2 μg/mL，加入96孔ELISA板，50 μL/孔，4℃静置16 h；以含0.05%吐温-20 的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution-twain，PBST）洗涤3 次，加入5%的脱脂奶300 μL/孔，37℃静置2 h；再以PBST 洗涤6 次，随后向检测孔中加入1∶200 稀释的梅毒螺旋体阳性患者血清样本，对照孔分别加入1∶500 稀释的阳性或阴性标准血清。37℃温箱孵育30 min，以PBST洗涤6 次，再加入1∶2 000 稀释的HRP 标记的羊抗人IgG，孵育30 min。PBST 洗涤6 次后加入显色液，以2 mol/L H2SO4反应终止反应，读取OD450值。结果判定：S/N＞2.1 判为阳性，其中++++为OD450＞0.59，+++为OD450＞0.4，++为OD450＞0.3；+为S/N＞2.1 但OD450≤0.3

1.2.6 TP17 重叠多肽抗原性检测 采用ELSIA 方法检测6 条BSA 耦联的TP17 多肽与10 份梅毒阳性患者血清的反应性。以CBS 缓冲液稀释耦联多肽抗原至终浓度为2 μg/mL 进行抗原包被，以1∶500稀释的血清样品为一抗，1∶2 000 稀释的HRP 标记的羊抗人IgG 为二抗，进行ELSIA 检测，检测及结果判定方法同1.2.4。

1.1 一般资料 选择2010年1月至2015年12月因ACS在复旦大学附属上海市第五人民医院行冠脉介入治疗的患者。入选标准：就诊时年龄≥75岁，能配合手术治疗；估算肾小球滤过率(eGFR)>30 mL·min-1·1.73 m-2；无出血。排除标准：合并肿瘤等终末期疾病；无法配合术后规则用药。共入选181例患者，其中男性110例、女性71例，年龄75～89岁。其中，ST段抬高型急性心肌梗死(STEMI )60例，肌钙蛋白I(TNI)阳性116例，急诊冠脉介入治疗44例。患者入院时均进行BI评分。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0 统计软件对本实验相关数据进行统计分析，组间两两比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异显著具有统计学意义。

2 结果

2.1 TP17 蛋白的生物学特征与二级结构预测 TP17蛋白全长156 个氨基酸残基，分子量约16.5 kD，理论等电点（pI）8.62；经SignalP-5.0 分析TP17 蛋白N 端22 个aa 为信号肽，信号肽切割位点在Cys22～Val23 之间；TMHMM 2.0 预测TP17 蛋白存在2 个潜在的N-糖基化位点Asn68 和Asn128 和4个O-糖基化位点Thr13、Thr17、Thr19 及Thr21。同源进化分析结果显示，TP17 蛋白与大肠杆菌的铜抗性脂蛋白NlpE 具有20%的序列同源性，属于同一进化分支（图1）。

图1 TP17 蛋白同源进化分析Fig 1 Homologous evolution analysis of TP17 protein

SOMPA 分析结果显示TP17 蛋白二级结构无规卷曲（Random coil，c）约占42.31%、α 螺旋（Alpha helix，h）占25.64%、延伸链（Extended strand，e）24.36%、β转角（Beta turn，t）7.69%（图2）；DNASTAR 中Garnier-Robson 方法和Chou-Fasman 方法预测的TP17 蛋白二级结构中α 螺旋、β 折叠、转角及无规卷曲区域略有差异（图2），其中SOMPA 预测的无规卷曲部分与DNASTAR 软件中的转向（Turn，Regions）和卷曲（Coil，Regions）部分有重复的区域主要位于：Cys29～Ala35、Gly51～Cys58、Lys82～Thr94、Ser109～Lys119、Gly134～Ala146。

图2 TP17 蛋白的二级结构预测Fig 2 Prediction of secondary structure of TP17 protein

2.2 TP17 蛋白的线性 B 细胞表位预测DNASTAR 和IEDB 综合分析预测TP17 蛋白的抗原性、柔韧性、亲水性、表面易接近性等（图3）与B 细胞表位密切相关的结构信息，采用Bepipred 预测TP17蛋白的线性B 细胞表位，Bepipred Linear Epitope PredictionResults2.0（阈值=0.50），获得4 条线性B 细胞表位：Thr27～Gly47、Gln74～Pro88、Ile102～Ile125、Ala135～Lys152，Bepipred Linear Epitope Prediction Results（阈值=0.35）共获得7 条线性B细胞表位：Pro30～Glu38、Leu53～Asp62、Thr64、Thr66～Glu74、Lys82～Tyr91、Ser110～Lys119、Tyr132～Met145。

图3 TP17 蛋白的B 细胞表位预测Fig 3 Prediction of B cell epitopes of TP17 protein

2.3 TP17 蛋白三级结构同源建模及B 细胞表位定位 采用SWISS-MODEL，基于参考模型（PDB：4u3q）生成完整TP17 蛋白三维结构（图4）。结果显示，TP17 蛋白富含8 个β-折叠和2 个β-螺旋结构，其β-转角与二级结构预测结果有一定符合度，最终预测表位区Thr27～Glu38、Leu53～Asp62、Thr66～Gln74、Lys75～Pro88、Leu107～Lys119以及Tyr132～Met145 展示在TP17 蛋白分子表面（图4），主要位于无规卷曲区和β-折叠片的转折区域。

图4 TP17 蛋白的三级结构预测Fig 4 Prediction of three dimensional structure of TP17 protein

2.4 TP17 蛋白构象B 细胞表位预测分析结果如图5所示，TP17蛋白的氨基酸区域为：Lys34～Ala35、Ala55、Pro88、Glu99、Pro136～Pro147、Thr154，分布于三维结构外侧以黄色区域标注。

图5 TP17 蛋白的构象型B 细胞表位预测Fig 5 Prediction of conformational B cell epitopes of TP17 protein

2.5 TP17 蛋白及其分段多肽的合成及鉴定 SDSPAGE 鉴定结果表明，TP17 蛋白的纯度约为95%，浓度为2 g/L，HPLC-MS 检测结果显示成功合成的多肽Tp17-1 分子量为3.12 kD、Tp17-2 为3.05 kD、Tp17-3 为3.25 kD、Tp17-4 为3.44 kD、Tp17-5 为3.41 kD、Tp17-6 为3.68 kD。6 段多肽与BSA 耦联后进行鉴定，SDS-PAGE（图6）结果显示6 段多肽均耦联成功。

图6 重组表达蛋白TP17 及重叠多肽耦联物的SDS-PAGE 鉴定Fig 6 Identification of recombinant protein TP17 and overlapping polypeptide conjugates by SDS-PAGE

2.6 临床阳性血清样品与TP17 蛋白及多肽的反应 ELISA 检测结果10 份梅毒阳性的临床血清均与TP17 蛋白具有良好反应性，OD450值在0.59～1.45；而不同阳性血清与TP17 蛋白的重叠多肽的反应情况存在一定差异，其中10 份临床阳性血清样品与Tp17-1、Tp17-2、Tp17-3、Tp17-4 及Tp17-6均可发生特异性反应，且与阴性对照相比差异显著（P＜0.05）；有9 份临床阳性血清样品与Tp17-5均可发生特异性反应，且与阴性对照相比差异显著（P＜0.05），仅第5 份阳性血清与Tp17-5 多肽反应性较差，与阴性对照相比差异不显著（P=0.058）。以检测品OD 值（S）/阴性血清OD 值（N）大于2.1 为判断标准，所有多肽与临床阳性血清检测结果均可判断为阳性（S/N＞2.1）。见图7、表3。

图7 临床阳性血清样品与TP17 蛋白及重叠多肽的反应性分析Fig 7 Reactivity analysis of clinical positive serum samples with TP17 protein and overlapping polypeptides

表3 多肽对应的B 细胞表位及阳性血清ELISA 反应结果Tab 3 Peptide corresponding B cell epitope and positive serum ELISA results

3 讨论

TP17 是一种附着于梅毒螺旋体外膜内小叶的脂蛋白，约占TP 可溶性蛋白的2%，具有良好的抗原性和免疫原性。B 细胞表位是抗体在抗原表面的识别位点，在临床诊断和疫苗设计中起着重要作用，关于TP17 蛋白B 细胞表位的研究较少。随着蛋白质结构和抗原表位研究的发展，生物信息学预测B 细胞表位的准确性也逐步提升。通常情况下，β 转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环（loop），而loop 区利于抗体的结合，因此表位多含有环状结构，而螺旋和折叠结构比较少见，很多蛋白质的C 端具有较好的亲水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原决定簇区域[19]。本研究通过DNASTAR Protean 及SOPMA 预测分析TP17 蛋白的二级结构，分析其α 螺旋、β 折叠、转角及无规卷曲等二级结构元件的分布情况，结果显示无规卷曲（42.31%）和β转角（7.69%）在TP17 蛋白的二级结构中占比较高，结合IEDB 数据库软件BepiPred、SOPMA 以及DNASTAR 等对TP17 蛋白进行B 细胞表位分析，采用Hopp-Woods 和Kyte-Doolittle方案、Karplus-Schultz 和Emini 方案、Jameson-Wolf 方案等预测TP17 蛋白亲水性、柔韧性、表面可及性、可塑性特征，综合预测TP17 蛋白的7 个B 细胞线性表位Pro30～Glu38、Leu53～Asp62、Thr64、Thr66～Gln74、Lys82～Tyr91、Ser110～Lys119、Tyr132～Met145。为了增加表位预测的准确性，本研究基于SWISS-MODEL 同源建模构建TP17 蛋白的三维结构，结合IEDB 数据库预测分析TP17 蛋白的构象表位区域：Lys34～Ala35、Ala55、Pro88、Glu99、Pro136～Pro147、Thr154。结合已解析的TP17 蛋白三维结构数据（4u3q）和同源建模结果，将前述7 个线性B 细胞表位进行定位分析，修正后获得6 个TP17 蛋白的线性B 细胞表位：Thr27～Glu38、Leu53～Asp62、Thr66～Gln74、Lys75～Pro88、Leu107～Lys119 以及Tyr132～Met145。

为了验证表位预测的准确性，本研究分段合成了TP17 蛋白多肽（表3），覆盖蛋白所有氨基酸序列并进行了交叉重叠。选择10 份梅毒螺旋体抗体及TRUST 双阳性的临床血清样本与TP17 蛋白及Tp17-1～Tp17-6 这6 段多肽进行ELISA 检测，结果发现，TP17 蛋白与临床阳性血清样本具有良好反应性，而不同阳性血清与6 段多肽均能发生特异性反应，但反应情况存在一定差异，与阴性血清均不反应，表明这6 段多肽均含有B 细胞表位，也验证了本研究预测的抗原表位信息具有较高准确性。本研究分析了TP17 蛋白的B 细胞抗原表位，揭示了TP17 蛋白良好抗原性的分子基础，为梅毒螺旋体的抗体检测和疫苗设计提供了理论依据。