肾上腺皮质癌中CENPF基因的表达及对患者治疗和预后的影响

王 莉，李 丹，唐 凯，黄育刚

肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma,ACC)是一种发生于肾上腺皮质的较为罕见的恶性肿瘤，易发生局部浸润和转移，约占原发性肾上腺瘤的14%[1]。ACC患者预后较差，有局部晚期疾病的ACC患者5年生存率为35%～50%，有远处转移患者的5年生存率为0～28%[2]。目前，外科手术或基于米托坦-铂的化学疗法仍然是唯一有效的治疗策略[1-3]。因此，提高ACC的早期诊断率、发现评估预后的新指标和抗肿瘤治疗的新靶点已成为ACC研究的焦点。着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)是细胞周期相关核抗原，参与细胞周期的调控[4-5]。研究表明，CENPF参与多种肿瘤的发生，包括肝癌[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌等[8]；但国内外鲜有CENPF在ACC中表达的报道。本文根据肿瘤基因相关公共数据库对ACC中CENPF的表达、预后的相关性及生物学功能进行初步分析，以提高临床与病理医师对ACC的认识水平，为ACC的预后或治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2011年1月～2021年5月湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院病理科ACC 6例、肾上腺皮质腺瘤12例及正常肾上腺皮质12例(对照组)，患者均有完整的临床病理资料，术前均未行放、化疗。本实验经我院伦理委员会批准，患者或家属均知情同意。

1.2 免疫组化手术标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规HE、免疫组化EnVision两步法染色。兔抗人CENPF一抗(Abcam公司，稀释比1 ∶500)37 ℃孵育60 min，HRP二抗(福州迈新公司)37 ℃孵育30 min，苏木精复染30 s。光镜下观察CENPF蛋白的表达，每个组织随机选择3个视野(400×)进行计数，并计算CENPF阳性细胞百分比，即CENPF阳性细胞率=CENPF阳性细胞计数/肿瘤细胞计数×100%。所有切片均经两位病理医师采用双盲法阅片。

1.3 细胞系RNA干扰实验及RT-PCR设计干扰性小分子RNA(siCENPF)，探讨CENPF在人ACC细胞系SW13细胞中的功能。用50 nmol/L的CENPF-siRNA(siCENPF组)或对照siRNA(siNC)分别转染人SW13细胞48 h。siCENPF引物：5′-GACCCA GAAACUAGCUUAUTT-3′；siNC引物：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3′。使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)从SW13细胞中提取总RNA。利用Oligo(dT)引物和逆转录酶生成的cDNA，运用QuantiTect-SYBR-Green-PCR-Master-Mix试剂盒(德国Qiagen公司)和ABI-Prism 7000分析仪(美国Applied Biosystems公司)行实时定量PCR检测。CENPF：正向引物5′-AGCACTGATCACCTGTTAGC-3′，反向引物5′-ACCCACATACAAACAGAGATTG-3′；内参基因GAPDH：正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTG GTCGTAT-3′，反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTG GTGAAGAC-3′。所有实验均重复3次，使用2-ΔΔCt法计算siCENPF组和对照组中CENPF mRNA水平，引物均由上海生工生物公司合成。

1.4 Western blot法用siCENPF和siNC分别转染人SW13细胞48 h，收集细胞，提取蛋白。加入CENPF一抗(Abcam公司，稀释比1 ∶500)，4 ℃孵育细胞膜过夜；与HRP二抗结合的IgG抗体室温下孵育1.5 h。ECL化学发光试剂盒显色。

1.5 CCK-8细胞增殖实验将人SW13细胞以100 μL(合计2×103个细胞)接种于96孔板，分别转染50 nmol/L的siCENPF和siNC。向每孔中添加10 μL CCK-8试剂(上海碧云天生物公司)。细胞在培养箱中培养24、48、72和96 h,分别测量各时间点在450 nm处的吸光度值(OD)。

1.6 划痕试验将人SW13细胞接种于DMEM(含10%胎牛血清)的12孔板中，用50 nmol /L siCENPF和siNC分别转染细胞48 h。用20 μL移液管尖划痕；每孔再用PBS冲洗5次，以清除划痕上的漂浮细胞，并向每孔中添加3 mL 10%FBS、含1%抗生素的DMEM。在0、48 h拍摄划痕区域，48 h内细胞迁移的宽度=0 h划痕宽度-48 h划痕宽度。

1.7 肿瘤数据库的信息分析本实验根据GEO数据库查询与ACC研究相关的所有数据集，研究资料包括人ACC及其邻近或正常肾上腺皮质组织，筛选得到数据集：GSE90713。在GEPIA基因数据服务平台可检索到 TCGA数据库和GTEx项目的79例ACC和128例正常样本的RNA测序表达数据。本实验应用GEPIA平台进行肿瘤及正常组织中CENPF的差异表达、病理分期、CENPF相关的表达、基因相关性及患者生存分析。

1.8 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，应用t检验对正常组织与ACC组织中CENPF的表达差异进行比较。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组间比较；应用χ2检验或Fisher精确概率法分析CENPF表达与临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier生存曲线分析CENPF表达对ACC患者预后的影响；应用Log-rank检验比较两组间的生存差异；并用Cox回归模型分析CENPF表达对生存期及临床特征(分期、分级等)的影响。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常肾上腺组织、肾上腺皮质腺瘤及ACC组织中CENPF的表达肾上腺皮质腺瘤的结节切面呈金黄色、质硬(图1A)；ACC切面的包膜完整或有缺陷，一些区域呈灰红色，有坏死(图1B)。HE染色示：正常肾上腺皮质的网状带细胞，胞质呈嗜酸性颗粒，细胞排列无特征性，空泡状、核仁小(图2A)。肾上腺皮质腺瘤肿瘤细胞呈巢、团状分布，胞质丰富，呈嗜酸性，可见小核仁(图2B)。ACC细胞呈片状或大的巢、团状排列，被纤细的窦系网状结构分隔，癌细胞生长密集，核仁清楚(图2C)。免疫组化检测显示：CENPF在肾上腺皮质腺瘤组和正常肾上腺组中均呈低表达或不表达(图3A、B)，在ACC中呈核表达，且表达量显著高于肾上腺皮质腺瘤及正常肾上腺组织(图3C)。CENPF在ACC组织中的阳性率显著高于正常肾上腺皮质、肾上腺皮质腺瘤(图4)。本组6例ACC中CENPF均阳性，其中5例CENPF的阳性细胞率>10%，1例CENPF的阳性细胞率约8%。而CENPF在肾上腺皮质腺瘤及对照组中大多数不表达(阳性细胞率0～2%)。

图1 A.肾上腺皮质腺瘤的结节切面呈金黄色、质硬；B.肾上腺皮质癌切面的包膜完整或有缺陷，一些区域呈灰红色，有坏死

图2 A.正常肾上腺皮质的网状带细胞，胞质呈嗜酸性颗粒，细胞无特征性排列，空泡状、核仁小；B.肾上腺皮质腺瘤的肿瘤细胞呈巢、团状分布，胞质丰富，呈嗜酸性，可见小核仁；C.肾上腺皮质癌肿瘤细胞呈片状或大的巢、团状排列，被纤细的窦系网状结构分隔，癌细胞生长密集，核仁清楚 图3 A.CENPF在正常肾上腺皮质中低表达；B.CENPF在肾上腺皮质腺瘤中不表达；C.CENPF在肾上腺皮质癌中的染色呈核表达(红色箭头)，EnVision两步法

图4 不同肾上腺皮质组织中CENPF的表达：***P<0.001，ns为P>0.05

2.2 ACC中CENPF的表达差异为进一步验证CENPF在ACC中的表达，对GEO数据集应用GEO2R进行表达差异分析，GSE90713数据集包含5例正常肾上腺皮质组织和58例ACC组织。在GSE90713研究芯片中，CENPF mRNA在ACC中的表达量高于正常肾上腺皮质组织(P=0.000 7，图5A)。在GEPIA平台中，数据库包含128例正常肾上腺皮质组织和79例ACC组织。本组结果显示：CENPF mRNA在ACC中的表达量高于正常肾上腺皮质(P<0.05，图5B)。此外，根据GEPIA平台的分析显示，在ACC患者中CENPF mRNA表达量与临床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)呈正相关(P=0.000 174，图5C)。这表明CENPF异常表达与ACC的恶化程度或疾病进展相关。

图5 肾上腺皮质癌中CENPF表达的差异：A.GSE90713的分析；B.GEPIA平台的分析：*P<0.05；C.CENPF mRNA表达量与TNM分期的分析

2.3 ACC中CENPF 表达与临床病理特征的关系根据TCGA肿瘤数据库中CENPF mRNA表达的中位值，将79例ACC分为低表达组(39例)和高表达组(40例)，分析CENPF表达与患者性别、年龄、临床分期、病理分级等相关性。在ACC中，CENPF表达与患者年龄、性别、肿瘤发生位置无关(P>0.05，表1)。随着临床分期升高，CENPF高表达者显著多于CENPF低表达者(尤其是TNM分期 Ⅲ、Ⅳ期，P<0.001)。CENPF高表达者更易发生肿瘤复发(P<0.001，表1)。肿瘤发生淋巴结转移的患者中，CENPF高表达者明显多于CENPF低表达者(P<0.001，表1)。

表1 肾上腺皮质癌中CENPF表达与临床病理特征的关系

采用Cox单因素、多因素回归分析，CENPF与患者年龄、性别、分级、TNM分期、发生肿瘤复发等临床因素对ACC患者预后的影响。Cox单因素回归分析显示：CENPF和TNM分期与ACC患者的预后相关(P<0.01，表2)。Cox多因素回归分析显示：CENPF和TNM分期可能是ACC患者的独立预后因素(P<0.01，表2)。

表2 肾上腺皮质癌中CENPF的Cox单因素、多因素回归分析

2.4 ACC中CENPF表达与预后的关系为进一步分析CENPF基因表达与ACC患者预后的关系，根据CENPF mRNA表达的中位值将ACC患者分为CENPF高表达组和CENPF低表达组，应用GEPIA平台绘制生存曲线。结果显示：CENPF表达与患者预后，即总生存率、无进展生存率均呈显著负相关(HR=8.88,P=0.000 24；HR=4.12,P=0.001 7，图6)。

图6 肾上腺皮质癌中CENPF表达与患者预后的关系 A.CENPF表达与肾上腺皮质癌患者总生存率的关系；B.CENPF表达与肾上腺皮质癌患者无进展生存率的关系

2.5 CENPF在细胞系SW13中的RNA干扰实验为探索CENPF基因在ACC发生、发展中的生物学功能，本实验构建了CENPF的表达抑制体系，应用人SW13细胞转染siCENPF后，siCENPF组中CENPF mRNA(P<0.01，图7A)和蛋白(P=0.001 1，图7B、C)的表达显著被抑制，表明CENPF表达干扰体系构建成功。CCK-8细胞分裂实验结果显示：与siNC组相比，抑制CENPF表达(siCENPF)的SW13细胞生长速度显著受到抑制(P<0.01，图8)。划痕实验结果显示：与siNC相比，抑制CENPF表达(siCENPF)后，SW13细胞的迁移速度显著受到抑制(P=0.005 3，图9)。

图7 CENPF在肾上腺皮质癌细胞SW13中的siRNA体系的建立：A.实时定量PCR检测CENPF mRNA相对表达，**P<0.01；B.Western blot检测CENPF蛋白的表达；C.蛋白表达的灰度值分析

图8 CCK-8细胞增殖能力实验：检测CENPF对SW13细胞增殖的影响：**P<0.01，*P<0.05

图9 划痕实验分析CENPF对SW13细胞迁移能力的影响

3 讨论

ACC是一种较为少见的恶性肿瘤，文献报道较少[9-10]。目前，外科手术、化疗分别是治疗早、晚期ACC的主要方式。近年大量文献表明：WNT-β-catenin、p53-RB信号通路、错配修复相关酶的缺陷和TERT基因表达异常，与ACC的疾病进展及预后相关[11-13]。但这些基因异常表达或信号异常调控只存在于ACC少部分患者中[10]，因此寻找ACC发生、发展的关键分子或靶点，对治疗ACC具有重要的临床意义。

近年越来越多的证据表明，CENPF的过度表达或激活是恶性肿瘤的常见行为，与肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的恶化和预后不良密切相关。然而，CENPF在ACC患者中的表达模式和确切作用尚不清楚，其分子机制和功能也未见报道。本组通过对临床样本及肿瘤数据库(GEO和GEPIA)中CENPF相关基因信息的分析，发现CENPF在ACC中显著高表达，CENPF基因高表达与TNM分期呈正相关、与患者预后呈显著负相关；表明CENPF表达可能促进ACC的疾病进展。此外，在ACC中CENPF表达与TNM分期、肿瘤复发、是否发生淋巴结转移密切相关(P<0.001)；与患者年龄、性别、肿瘤发病部位无关(P>0.05)。CENPF表达、TNM分期与ACC患者的预后相关，且可能是ACC患者的独立预后因素。在ACC中CENPF可能通过调控细胞的分裂、迁移，促进ACC的发生或进展。以上结果拓展了ACC的相关研究，分析CENPF与ACC发病及进展的相关性，为下一步的分子机制实验研究提供线索与依据。本文也存在一定的局限性，由于收集样本量较少，CENPF与ACC发病及进展的相关性、预后信息等皆以生物信息学分析为基础，故以上结论仍需要进一步的分子实验及临床样本来验证。