蚯蚓-香根草联合作用对复垦土壤重金属Cr、Cu、Pb和Zn的影响

鲁福庆，王兴明,2,3①，储昭霞，范廷玉，徐晓平

(1.安徽理工大学地球与环境学院，安徽 淮南 232001；2.金属矿山安全与健康国家重点实验室/ 中钢集团马鞍山矿山研究总院股份有限公司，安徽 马鞍山 243071；3.皖江流域退化生态系统的恢复与重建省部共建协同创新中心/ 安徽师范大学生命科学学院，安徽 芜湖 241000；4.淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038；5.安徽工程大学建筑工程学院，安徽 芜湖 241000)

煤炭开发利用会带来土地沉陷问题[1]，目前，我国土地沉陷面积已超过200万hm2，到2030年预计将达到280万hm2[2]，这给我国耕地保护带来严峻考验，因此对采煤沉陷地进行复垦具有重要意义。利用煤矸石充填复垦是治理矿区沉陷的有效手段之一，但煤矸石充填复垦土壤会抑制农田作物正常生长[3]，同时，煤矸石含有的重金属元素向复垦土壤迁移，会增加土壤被重金属污染的风险[4]。重金属具有不可降解性和生物累积特性，复垦土壤重金属累积会对土壤生态系统和人类健康造成持续威胁[5]。因此，对重金属污染复垦土壤进行治理显得尤为重要。目前，通常采用的治理措施包括工程措施、农艺调控、钝化阻控技术和生物修复等，其中，生物修复因具有无二次污染、成本低的优点而受到广泛关注。生物修复是利用土壤中植物、动物和微生物的生命活动吸收、转化或降解土壤有害物质[6-7]，采用动物或微生物联合的植物修复不仅集合了单一物种修复的优势，而且动植物联合产生的协同作用能够强化修复效果[8]。

蚯蚓是土壤中生物量最大的动物类群之一，能促进土壤有机质矿化、养分产生和植物生长[9]，蚯蚓的挖掘和排泄活动能够疏松土壤，提高通气性，促进植物生长[10]，蚯蚓能够对土壤中重金属产生影响，如CHENG等[11]发现蚯蚓能够降低土壤中Cd生物有效性，王丹丹等[12]发现接种蚯蚓能提高土壤有效态Cu含量，这是由于蚯蚓能富集土壤中重金属，并通过吞食、消化和排泄等活动改变重金属活性[13]，提高其他生物对土壤重金属的吸收量。香根草(Vetivergrass)是一种优良重金属污染土壤修复植物[14]，对Cd、Cr、Pb和Ni 4种重金属具有较高富集性[15]，马文超等[16]通过盆栽试验发现香根草可降低土壤总Cd含量，香根草能够作为Cd污染土壤植物修复物种。香根草对重金属的生物富集能力取决于其根系的吸收能力[15]，香根草具有生长迅速、根系发达、对重金属的耐受性高的特点，因此，香根草在矿区植物修复方面具有很大应用潜力[17]。然而，单独采用植物修复重金属污染土壤的效率低，这限制了植物修复在矿区复垦土壤治理中的应用，而采用动植物联合方式修复复垦土壤的研究尚鲜有报道。因此，研究蚯蚓-香根草联合处理对复垦土壤重金属Cr、Cu、Pb和Zn总量及有效态含量的影响，通过分析覆土理化性质与重金属含量之间的相关性，探究蚯蚓联合香根草对复垦土壤重金属的生态功能及调控机制，以期为动物联合植物修复重金属污染复垦土壤提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

煤矸石采集于淮南市某煤矸石山，试验土壤取自该煤矸石山周边农田(32°47′12.1″ N、116°33′09.0″ E)，土壤类型为黄棕壤，土壤和煤矸石经自然风干后，过2 mm孔径筛，用于土柱试验。土壤和煤矸石基本理化性质见表1。香根草(Vetivergrass)种子购自宿迁某种业公司，种子经w为30%的H2O2消毒浸泡后催芽，选择植株生长状况良好、大小基本一致的2周幼苗移栽至土柱中[18]。供试蚯蚓来源于江苏省宿迁市某蚯蚓养殖基地，品种为赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)，试验前将蚯蚓置于试验土壤中驯化7 d，选择活性高、体型基本一致的成熟蚯蚓进行试验。

表1 供试材料基本理化性质

1.2 试验设计

试验装置采用直径为10 cm的PVC管柱，每根土柱底部填充10 cm厚煤矸石，覆土厚度设为50(A组)和70 cm(B组)2组[4,19]，每组试验分别设置不接种蚯蚓+不种植香根草(CK)、单独种植香根草(V)、单独接种蚯蚓(E)和接种蚯蚓+种植香根草(VE)4个处理，每个处理设3个重复。试验装置设计见图1。

CK为不接种蚯蚓+不种植香根草处理，V为种植香根草处理，E为接种蚯蚓处理，VE为接种蚯蚓+种植香根草处理。

试验前，V和VE处理每根土柱分别移植5株香根草，同时，E和VE处理每根土柱接种10条蚯蚓，并在PVC管口采用尼龙纱网密封防止蚯蚓逃逸。试验于室内光照培养架上进行，期间室内温度保持在(25±3) ℃，采用重量法维持土壤含水率为田间最大持水量的70%，试验时间为30 d[20]。试验结束后，将香根草和蚯蚓挑出，蚯蚓平均生存率在90%以上，并将PVC管切割后取出土壤层，每个土柱土壤混匀后采用四分法采集土壤样品，经自然风干、研磨过筛后用于后续试验。

1.3 指标测定方法

土壤pH值采用电位法〔m(水)∶V(土)为1∶5〕，土壤有机质(OM)含量采用重铬酸钾-外加热法测定，土壤总氮(TN)、总磷(TP)和总钾(TK)含量按照土壤农化常规分析方法[21]测定。将香根草地上部和地下部分开后，采用去离子水冲洗干净，在105 ℃条件下烘干，采用天平称量每株香根草地上部和地下部干重。

土壤重金属总量采用HF-HClO4-HNO3消解法测定，土壤重金属有效态含量采用DTPA〔pH为7.3，m(液)∶V(土)为2∶1〕进行浸提[22]，重金属含量采用原子吸收分光光度计(TAS-986系列)测定，分析过程加入国家土壤标准样品GBW07403(GSS-3)进行质量控制，各元素加标回收率为91%～103%，符合元素分析质量控制标准。

1.4 数据处理与统计分析

数据统计分析采用Excel 2019和SPSS 24.0软件，不同处理间指标差异性分析方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和差异显著性检验(Duncan)；制图采用Origin 2020软件。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓-香根草对覆土理化性质的影响

由图2可知，2种厚度覆土pH值均呈中性至微碱性。与CK相比，单独种植香根草、单独添加蚯蚓和蚯蚓-香根草联合处理均能降低覆土pH值，各处理覆土pH由高到低依次为CK、V、E和VE处理，且A、B组中VE处理覆土pH均显著小于其他处理(P<0.05)，表明蚯蚓-香根草联合处理对降低覆土pH值的效果最优。

由图2可知，V、E和VE处理覆土OM含量均高于CK，A、B组E处理覆土OM含量均较CK提升最大，分别为12.91%和14.20%。与CK相比，V、E和VE处理覆土TN含量均显著提升(P<0.05)，A、B组各处理覆土TN含量由高到低均为VE、V、E和CK，且VE处理均较CK提升最大，分别为57.14%和55.17%。A、B组V和VE处理覆土TP含量较CK显著提升(P<0.05)，且VE处理均较CK提升最大，分别为47.55%和45.71%。各处理土壤TK含量较CK提升不明显。这表明蚯蚓-香根草联合处理对土壤OM、TN和TP含量改良效果最好。差异性分析结果表明，不同覆土厚度同一处理土壤pH和OM含量间呈显著或极显著差异(P<0.05、P<0.01)，而A、B组土壤TN、TP和TK含量差异不显著。

同一幅图中，同一组直方柱上方英文小写字母不同表示同一覆土厚度不同处理间某指标差异显著(P<0.05)；同一幅图中， 同一组直方柱上方*和**分别表示同一处理不同覆土厚度间某指标差异显著或极显著(P<0.05，P<0.01)。

2.2 蚯蚓-香根草对覆土重金属的影响

2.2.1蚯蚓-香根草对覆土重金属总量的影响

由图3可知，与CK相比，A、B组V、E和VE处理均能显著降低土壤总Cr、Cu、Pb和Zn含量(P<0.05)。其中，各处理总Cr和Cu含量由高到低依次为CK、V、E和VE处理，而总Pb和Zn含量由高到低依次为CK、E、V和VE处理，可见，2种覆土厚度土壤重金属含量均为VE处理较CK降低最大。与CK相比，A组土壤总Cr、Cu、Pb和Zn含量最大分别降低4.90%、13.12%、10.36%和6.91%，B组最大分别降低5.47%、11.20%、10.34%和6.96%，这说明单独接种蚯蚓、单独种植香根草和蚯蚓-香根草联合作用均能降低复垦土壤重金属含量，其中，蚯蚓-香根草联合作用(VE处理)降低效果显著优于单独作用(V和E处理)。差异性分析结果表明，同一处理中仅A、B组E处理总Cr和Zn含量以及V和VE处理总Cu含量之间呈显著差异(P<0.05)，其他同一处理在A、B组间重金属总量差异性不显著，这表明种植香根草条件下覆土厚度对土壤重金属总量影响较小。

同一幅图中，同一组直方柱上方英文小写字母不同表示同一覆土厚度不同处理间某指标差异显著(P<0.05)； 同一幅图中，同一组直方柱上方*表示同一处理不同覆土厚度间某指标差异显著(P<0.05)。

2.2.2蚯蚓-香根草对覆土有效态重金属的影响

有效态重金属更容易被土壤基质中生物吸收、同化和利用[23]。由图4可知，A、B组中，E处理土壤有效态Cu、Pb和Zn含量均高于CK，V和VE处理则小于CK。B组E处理有效态Cr含量较CK显著升高，V和VE处理则显著降低(P<0.05)，这表明接种蚯蚓均能提高重金属有效性，种植香根草能降低Cu、Pb和Zn有效性。

同一幅图中，同一组直方柱上方英文小写字母不同表示同一覆土厚度不同处理间某指标差异显著(P<0.05)； 同一幅图中，同一组直方柱上方*表示同一处理不同覆土厚度间某指标差异显著(P<0.05)。

当蚯蚓-香根草联合作用时，A、B组有效态Cu含量较CK分别降低6.12%和7.75%，有效态Pb含量分别降低0.24%和0.85%，有效态Zn含量分别降低1.48%和9.15%，蚯蚓-香根草联合作用对有效态Pb含量的降低效果较弱，对有效态Cu和Zn含量的降低效果较强。A、B组VE处理土壤有效态Cr含量以及E、V和VE处理有效态Zn含量间分别呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异，这表明接种蚯蚓和种植香根草时，覆土厚度会对土壤重金属有效Cr和有效Zn含量产生影响。

2.3 蚯蚓对香根草生长的影响

由图5可知，A、B组中，接种蚯蚓后，香根草地上部和地下部生物量均显著增加(P<0.05)，其中，A组中，VE处理香根草地上部和地下部生物量较V处理分别增加2.83%和36.64%；B组中，VE处理地上部和地下部生物量较V处理分别增加20.16%和121.37%，这表明接种蚯蚓能够增加香根草生物量，且对香根草地下部生物量增加效果比地上部生物量更为明显。此外，A组V和VE处理香根草生物量均高于B组，其中，A组V处理香根草地上部和地下部生物量较B组分别增加49.27%和108.62%，VE处理A组较B组分别增加12.34%和13.24%，这表明在高覆土厚度条件下接种蚯蚓对香根草生物量的增加效果更为明显。

同一幅图中，同一组直方柱上方英文小写字母不同表示同一覆土厚度不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.4 蚯蚓-香根草处理土壤理化因子与重金属的相关关系

为进一步研究接种蚯蚓对种植香根草复垦土壤的影响，分析单独种植香根草、蚯蚓香根草联合时土壤理化因子与重金属的相关关系。由图6可知，单独种植香根草时，土壤pH和OM含量与总Cu含量分别呈显著正相关和负相关(P<0.05)，其他土壤理化性质与重金属含量之间相关不显著。蚯蚓-香根草联合作用时，土壤pH与有效态Cr和Pb含量间呈显著负相关(P<0.05)；OM含量与有效态Cr和Pb含量呈显著负相关，与有效态Zn含量呈显著正相关(P<0.05)；土壤TN和TP含量与总Cu和总Pb含量呈显著负相关(P<0.05)。冗余分析结果表明，单独种植香根草时，覆土重金属主要受土壤pH以及OM和TK含量影响，土壤pH主要影响总Cu、总Pb和有效态Zn含量，OM含量主要影响总Zn和有效态Cu含量，TK含量主要影响有效态Pb含量；蚯蚓-香根草联合时，覆土重金属主要受pH和OM含量影响，pH主要影响总Cu、总Pb和有效态Zn含量，OM含量主要影响总Zn、有效态Zn和有效态Pb含量。以上结果表明在2种覆土厚度条件下，土壤pH和OM含量是影响土壤重金属含量的最主要因子。

3 讨论

3.1 蚯蚓-香根草对覆土理化性质的影响

该研究中，VE处理覆土pH值降低，这与WANG等[24]和徐坤等[25]研究结果相似，这可能是蚯蚓通过排泄氮素和分泌钙腺来调节土壤pH，蚯蚓排出的蚓粪及表皮分泌的有机酸也能降低土壤pH[26]。同时，香根草根系在蚯蚓刺激作用下能够分泌有机酸，使覆土pH降低。土壤养分对复垦土壤后续利用有重要影响，HU等[27]发现在苜蓿地接种蚯蚓能显著增加土壤OM含量，TAMARTASH等[28]也发现蚯蚓能够在灌丛、草地和裸露植被地区提升土壤有机碳、钾和氮含量。笔者研究也发现2种覆土厚度中，V、E和VE处理均能提升土壤OM、TN和TP含量，接种蚯蚓和种植香根草提升土壤养分的原因可能是蚯蚓能通过排泄增加土壤OM含量，同时，蚯蚓刺激香根草根系分泌的代谢产物增加了土壤有机质[29]，而蚓粪中含有的磷酸酶能使土壤TP含量增加[30]，蚯蚓体内微生物也能促进有机物分解，释放出N、P等元素[31]，从而增加覆土TN和TP含量。蚯蚓与香根草联合作用时，蚯蚓能改善土壤性状及促进植物生长[32]，而植物生长也能增加土壤有机碳、交换性磷和钾含量[33]，同时植物根系的生长也能为蚯蚓提供良好生存环境，由此，蚯蚓和香根草协同作用(VE处理)对覆土的改良效果较V和E处理更为明显。

Cra、Cua、Pba和Zna分别表示有效态Cr、有效态Cu、有效态Pb和有效态Zn。(a)、(b)图中蓝色箭头表示环境因子， 红色箭头表示重金属，夹角为锐角表示环境因子与重金属呈正相关，夹角为钝角则表示环境因子与重金属呈负相关。 (c)、(d)图中红色表示正相关，蓝色代表负相关，颜色越深则相关性越大；*表示在0.05水平上显著。

3.2 蚯蚓-香根草对覆土重金属的影响

单独接种蚯蚓和单独种植香根草能够降低覆土重金属总量，其原因可能是蚯蚓能通过表皮和肠道吸收重金属，蚯蚓黄色组织能够累积重金属，从而将重金属富集在蚯蚓体内[34]，此外，蚯蚓排出的蚓粪中富含腐殖酸，对重金属也有较强的吸附能力。香根草则能通过根部吸收重金属，其根系分泌的代谢产物能够促进覆土重金属溶解和增强根系对重金属的吸收能力[35]，进而降低土壤重金属含量。前人研究发现，蚯蚓-植物联合作用能够降低土壤重金属含量，如俞协治等[36]发现蚯蚓活动能显著促进黑麦草对Cu的吸收量，LEMTIRI等[37]证明蚯蚓能显著提高蚕豆和玉米对Cu、Zn、Pb和Cd的积累。笔者研究也发现类似规律，蚯蚓联合香根草降低重金属含量的效果优于蚯蚓或植物单独作用效果，这是因为蚯蚓能够将难溶性重金属活化，促进香根草大量吸收土壤重金属，同时，蚯蚓能活化土壤重金属使其转化为易被植物吸收的形态，进而提高植物对重金属的吸收效率[36]，香根草的生长能够为蚓粪中微生物提供良好的生存条件，促进重金属迁移转化，因此，蚯蚓-香根草联合产生的协同作用对重金属降低效果更加明显。

单独接种蚯蚓能提高土壤重金属有效态含量，其原因可能是蚯蚓肠道内微生物能促进有机物与重金属结合[38]，提高了重金属溶解性，进而提高土壤重金属生物有效性。单独种植香根草能降低土壤重金属有效态含量，其原因可能是香根草能直接吸收利用土壤有效态重金属，使得土壤重金属有效态含量降低[39]。蚯蚓-香根草联合作用能降低土壤有效态重金属，其原因可能是蚯蚓活动能促进植物根系生长及生物量增加[39]，而植物根系生长又能促进蚯蚓对重金属的富集。此外，蚯蚓表皮能分泌含有—COOH等活性基团的胶粘物质，能通过络合或螯合作用使土壤重金属稳定，进而降低重金属有效性[38]，蚯蚓体内酶的差异会导致其对重金属吸收能力的差异[38]，这可能是造成VE处理对土壤有效态Cu和Zn的降低效果更优的原因。

3.3 蚯蚓对香根草生长的影响

蚯蚓对促进植物生长具有良好作用，如HUANG等[40]发现蚯蚓粪便能够促进水稻生长，徐坤等[25]发现接种蚯蚓后印度芥菜地上部生物量增加22.6%～88.6%，笔者研究也发现类似规律，接种蚯蚓后香根草生物量增加，且香根草地下部生物量的增加效果更为明显，这可能是由于蚯蚓促进了植物对氮素等养分的吸收，进而促进香根草生长，而蚯蚓活动增加了土壤孔隙度和通气性，能促进香根草根系发育，同时，蚯蚓产生的有机酸、激素等则能进一步促进香根草根系生长[10,41]。而方青等[35]发现在2种覆土改良中，高厚度覆土对植物生长的促进作用更明显，这可能是由于高厚度土壤中植物根系生长空间更大，土壤能提供更多养分，进而使得香根草在高厚度覆土中生长状况更好。

3.4 蚯蚓-香根草处理土壤理化因子与重金属相关关系

蚯蚓可能会影响土壤性质，从而影响土壤重金属生物有效性[42]。徐坤等[25]发现蚯蚓能通过降低土壤pH进而增加Zn有效性，张晗等[43]发现矿区土壤Cu和Zn含量与pH和OM含量呈显著相关。此外，蚯蚓也能通过改变土壤碳、氮迁移，进而影响土壤重金属含量。而笔者研究发现pH和TP含量是影响重金属含量的关键因子，这是由于土壤pH可以控制重金属在土壤基质中的溶解和沉淀，改变重金属迁移和转化能力[44]，土壤含磷物质通过吸附作用或与重金属反应形成磷酸盐沉淀，从而钝化土壤重金属[45]。同时，接种蚯蚓和种植香根草能显著提高土壤TP含量，从而提高土壤钝化重金属的能力，进而导致土壤有效态重金属含量降低。由此推测，蚯蚓联合植物可通过改变覆土中重金属吸附性能或产生重金属沉淀来改变土壤重金属化学行为。因此，在矿区重构土壤的修复改良中，蚯蚓-香根草联合作用能降低重金属污染风险，同时也能有效改善复垦土壤肥力，为矿区后续开发利用提供保障。

4 结论

(1)土柱模拟试验结果表明，50和70 cm 2种覆土厚度中，单独种植香根草(V)、单独添加蚯蚓(E)和蚯蚓-香根草联合(VE)处理较CK均能降低覆土pH以及提升土壤OM、TN和TP含量，蚯蚓-香根草联合作用的降低或提升效果更明显。接种蚯蚓能够增加香根草生物量，且对香根草地下部生物量增加效果较地上部更好。

(2)2种覆土厚度中，V、E和VE处理较CK均能降低土壤总Cr、总Cu、总Pb和总Zn含量，且蚯蚓-植物联合(VE)降低效果均优于单独作用(V、E)。单独接种蚯蚓能提升有效态重金属含量，单独种植香根草则能降低有效态Cu、Pb和Zn含量，蚯蚓-香根草联合作用对土壤有效态Pb含量的降低效果较弱，对土壤有效态Cu、Zn含量的降低效果较强。

(3)相关性及冗余分析结果表明，土壤pH和OM含量是影响土壤重金属含量的关键因子。