熵权法联合Box-Behnken响应曲面法优选复方龙血竭双层膜中黄连提取工艺*

陈 坤，彭 霜，李 江，陈凌云，余晓玲，张韶湘△

(1.达州中医药职业学院，四川 达州 635000；2.普洱市民族传统医药研究所，云南 普洱 665000；3.云南中医药大学，云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500；4.昆明市中医医院，云南 昆明 650500)

“复方龙血竭”为云南中医药大学第三附属医院(昆明市中医医院)经验方，由龙血竭、黄连、冰片组成，具有活血、生肌、镇痛之效，临床疗效显著[1]，现代药理实验表明“复方龙血竭”对小鼠创面组织的具有良好的修复作用，可促进大鼠口腔溃疡伤口的愈合[2]，对于大鼠口腔黏膜溃疡具有良好的治疗效果[3]。方中龙血竭本就为提取物，无需再次提取，冰片为易挥发药物，故龙血竭、冰片直接加入黄连提取物当中混匀，课题组前期已完成复方龙血竭口腔溃疡双层膜的制备[3]。本文旨在阐述方中黄连提取优选的方法，为复方龙血竭双层膜的大生产工艺提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 CP124C-电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)；高效液相色谱仪(包括四元梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱，型号：UltiMate 3000)(DIONEX Limited，U.S)；色谱柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，)(Kromat Corporation)；分析天平(型号：AB265-S METTLER TOLEDO，0.00001 g)(Mettler-tolido international trade(Shanghai)Co.LTD)；分析天平(型号：AL104METTLER TOLEDO，0.0001 g)(Mettler-tolido international trade(Shanghai)Co.LTD)。

1.1.2 试药 盐酸小檗碱对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号：110713-201613)；黄连药材由昆明市中医医院提供；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 固定相：Eclipse XDB色谱柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 moL·L-1磷酸二氢钠溶液(30∶70)(用磷酸调节pH至3.0)；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：345 nm；进样量：10 μL，理论板数按盐酸小檗碱计算分别不低于3000。

1.2.2 溶液的配置 对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成0.357 mg·mL-1的对照品溶液。

提取物/黄连药材供试品溶液的制备：取黄连提取物0.01 g/黄连药材0.1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密吸取甲醇-盐酸(100∶1)溶液10 mL溶解，称重，超声30 min，放冷，在称定重量，用甲醇补足重量，再精密吸取溶液1 mL，加甲醇-盐酸(100∶1)溶液定容至25 mL容量瓶，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 专属性考察 精密吸取对照品溶液、药材供试品溶液和提取物供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，对照品溶液和供试品溶液中盐酸小檗碱色谱峰保留时间一致。结果表明：系统专属性良好。结果见图1。

1.2.3.2 线性与范围 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，制成每mL含有盐酸小檗碱257 μg，分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别定容于25 mL容量瓶，精密吸取各浓度对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积值为纵坐标(y)，以盐酸小檗碱浓度为横坐标(x)进行线性回归，得线性回归方程为y=46.21x-259.5(r=0.9998)，结果表明，盐酸小檗碱10.28～102.8 μg·mL-1范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系。

1.2.3.3 仪器精密度试验 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，按上述色谱条件重复进样6次，分别测定峰面积，计算RSD值为1.29%，表明该仪器精密度良好。

1.2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一盐酸小檗碱对照品溶液，黄连提取物供试品溶液10 μL，分别于1、2、4、8、12、24 h进样测定峰面积，并计算其RSD值分别为0.75%、1.25%，表明对照品及供试品溶液在24小时内稳定。

1.2.3.5 重复性试验 称取同一黄连提取物6份，各0.01 g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，并采用外标法计算各供试品含量，结果显示，黄连提取物平均含量为37.92 mg·g-1，RSD值为1.64%，表明该方法重复性良好。

A.盐酸小檗碱对照品溶液；B.药材供试品溶液；C.提取物供试品溶液；1.盐酸小檗碱

1.2.3.6 准确度试验 称取已知含量(37.92 mg·g-1)的黄连提取物6份，每份0.01 g，精密称定，精密吸取已知浓度(0.357 mg·mL-1)的盐酸小檗碱对照品溶液1.5 mL，按上述色谱条件进样分析，计算含量，盐酸小檗碱平均回收率为96.959%，RSD值为2.66%，结果见表1。结果表明，该方法回收率良好。

表1 准确度试验结果

1.2.4 评价指标

1.2.4.1 盐酸小檗碱的转移率的计算 黄连药材含量测定：取黄连药材0.1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密吸取甲醇-盐酸(100∶1)溶液10 mL溶解，称重，超声30 min，补足重量，再精密吸取溶液1 mL，加甲醇-盐酸(100∶1)溶液定容至25 mL容量瓶，摇匀，滤过，取续滤液，进样，计算含量，平行三次，结果见表2。结果表明：黄连药材中盐酸小檗碱含量为6.68%，符合2020版《中华人民共和国药典》一部黄连项下相关要求。

表2 黄连药材的含量测定结果

盐酸小檗碱转移率计算：已知黄连药材中盐酸小檗碱的含量为6.68%，则盐酸小檗碱的转移率=液相测得的盐酸小檗碱含量/6.68%×黄连药材用量×100%。

1.2.4.2 提取物得率计算 黄连提取物(干膏)得率公式：干膏得率(%)=黄连提取物/黄连药材用量×100%。

1.2.4.3 综合评分的计算 信息熵权重法(EWM)计算权重：设响应曲面试验原始数据为矩阵(Yij)，将其采用极值法(公式1)进行处理，转为(0，1)之间的数值得到响应原始矩阵[4]。根据公式(2)、(3)计算各指标信息熵“Hij=[0.9973，0.9981]，信息熵值越大，权重系数越低，信息效用值越低；计算盐酸小檗碱转移率、干膏得率两个指标权重系数分别为：59.24%，40.76%。

(1)

(2)

综合评分：以盐酸小檗碱的转移率及干膏得率的综合评分为指标，根据各权重系数，得综合评分=(盐酸小檗碱转移率/盐酸小檗碱转移率最大值×59.24%+干膏得率/干膏得率最大值×40.76%)×100。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 药材吸水率考察 取黄连药材粗粉7份，每份5 g，加入10倍量的水，分别于15、30、45、60、75、90、105 min后测定吸水率。(吸水率=[(饮片湿重-饮片干重)/饮片干重)]×100%)，结果显示各时间段吸水率分别为74.21%、78.94%、81.49%、85.25%、86.37%、86.39%、86.46%，结果表明，当浸泡时间为75 min，90 min，105 min时，吸水量不再升高，故选择75 min为最佳浸泡时间，此时的吸水率为86.37%，故在提取时，首次需加0.8倍量的水。

2.1.2 提取方法考察 以四种常用方法提取黄连，比较不同提取方法所得黄连提取物的含量及干膏得率，以“2.2”项下制备提取物供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定各提取物中的盐酸小檗碱含量，计算综合评分，优选最佳药材提取方法。四种提取方法试验结果见表3。

酸水浸提法：取黄连粗粉20 g，精密称定，加入0.2%硫酸溶液200 mL，浸渍24小时，滤过，滤渣同法提取1 次，合并滤液，加入氯化钠，使含盐量约达 4%(W/V)的浓度，搅拌，放置即有盐酸小檗碱沉淀析出，抽滤，得黄连提取物。

超声提取法：取黄连粗粉20 g，精密称定，加入0.2%硫酸溶液200 mL，超声处理60 min后过滤，滤渣同法提取1次，合并滤液，加入氯化钠，使含盐量约达 4%(W/V)的浓度，搅拌使氯化钠完全溶解，静置，抽滤，得黄连提取物。

回流提取法：取黄连20 g，精密称定，加入200 mL水，回流60 min，趁热过滤，加入4% NaCl，搅拌溶解，静置，滤渣同法提取1次，合并抽滤，即得黄连提取物。

食盐提取法：取黄连20 g，精密称定，加入200 mL水，同时加入8 g食盐，煎煮60 min，趁热过滤，静置析晶，抽滤，滤渣同法提取1次，合并抽滤，即得黄连提取物。

表3 黄连的4种提取方法试验结果

由表3可知，4种提取方法试验结果可以看出，干膏得率最高的是回流提取法为8.03%，盐酸小檗碱转移率最高的是超声提取法，其中回流提取法综合评分最高为96.43，故选择回流提取法对黄连进行提取。

2.2 Box-Behnken响应面法优化提取工艺

2.2.1 提取响应面法的因素水平确定及设计与结果 为优化回流提取方，在单因素考察的基础上，以加水倍数(A)、提取时间(B)、提取次数(C)3个因素为自变量，以干膏得率、盐酸小檗碱转移率的综合评分为响应值，进行三因素三水平中心组合设计，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行试验设计，优化水提取工艺，各因素及水平见表4。响应面试验设计及结果见表5。

表4 试验因素水平表

表5 响应面分析方案及结果

表6 回归模型的方差分析

2.2.2 响应面分析与优化 图2的响应曲面图和等高线图直观的反映了水提的各因素与响应值的交互作用。根据对综合评分的影响程度看，提取次数与提取时间交互作用影响显著，加水倍数和提取时间、加水倍数和提取次数交互作用影响不显著，所得结论与方差分析结果一致。

2.2.3 提取工艺的验证 通过响应面法分析，预测最佳提取工艺为：加水量为10倍、提取时间为1.76 h、提取次数为3次，综合评分理论预测值为99.23。为验证模型与实际结果的准确性，以实际操作为准，即以10倍水量提取3次，每次1.8 h，平行操作3次。验证结果见表7。

表7 提取工艺验证试验

由上表可知，干膏得率分别为12.54%、12.72%和12.55%，盐酸小檗碱转移率分别为63.97%、63.65%和64.02%，相应的综合评分为99.13、99.76、99.21，三者的RSD值分别为0.80、0.31%、0.35%(n=3)，结果显示，干膏得率、盐酸小檗碱转移率均合理，综合评分接近预测值，工艺稳定可行，具重现性和可操作性，证明优选条件可行。

图2 加水量与提取次数、加水量与提取时间、提取次数与提取时间的响应曲面图和等高线图

3 讨论

信息熵权重法(Entropy Weight Method，EWM)是一种客观赋权法，用来判断某个指标的离散程度，离散程度越大，该指标对综合评价的影响越大[5]。熵是不确定性的一种度量。信息量越大，不确定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不确定性越大，熵也越大[6]。相对于层次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)而言，以熵权法确定权重系数，更加注重了数据的客观性，而非决策者的主观认识及经验判断。同时采用响应面法可连续对实验各因素水平进行分析，能够将各因素具有代表性的条件进行组合实验[7]，回归拟合各因素与响应值的函数关系并进行分析，给出三维立体曲面图[8]，更直观地观察出优化区域，选择实验设计中的优化条件确定[9-10]。本方首次采用EWM法结合响应曲面法优化工艺各指标，使得出的相关数据更加科学、严谨。

方中龙血竭、冰片在制剂工艺成型中可直接入药，无需提取，且龙血竭中龙血素为脂溶性成分[11]，故未纳入评价指标。黄连具有清热燥湿，泻火解毒的功效，其有效成分为以小檗碱为代表的异奎宁类生物碱，具有抗心律失常[12]、抗高血压[12]、抗肿瘤[13]等药理作用，其治疗口腔溃疡的机制可能是通过竞争性抑制 PI3Kα、PI3Kγ、PI3Kδ、IKKβ 4个炎症靶标蛋白的活性，抑制炎症信号传递，从而发挥抗炎作用[14]。