母乳低聚糖对婴幼儿的健康影响及在配方奶粉中的应用

封肖颖, 荀一萍, 薛玉玲, 杨婉秋, 袁庆彬, 王世杰,2

（1.君乐宝乳业集团有限公司, 石家庄 050221；2.河北科技大学食品与生物学院, 石家庄 050018）

0 引言

世界卫生组织建议婴儿自出生至6个月内采用纯母乳喂养[1]。母乳作为婴幼儿最理想的天然食物, 含有多种营养成分, 可以满足婴幼儿正常的生长发育。母乳低聚糖在母乳中含量十分丰富, 仅次于乳糖和脂肪, 具有维持肠道微生态平衡、抑制肠道病原微生物感染、调节免疫反应、促进婴幼儿大脑发育等多种重要的生理作用[2-5]。目前国外已批准部分HMOs在婴幼儿配方食品中使用, 但我国尚未允许。国内婴幼儿配方食品常添加具有与某些HMO相似的功能性作用的不可消化的碳水化合物如低聚半乳糖（galactooligosaccharides, GOS）、低聚果糖（fructooligosaccharides, FOS）、聚葡萄糖等。然而, 这些碳水化合物无法代替HMOs的所有功能[6]。我国的母乳喂养率较低, 不同喂养方式婴幼儿的生长发育也存在一定的差异[7-8], 与纯母乳喂养的婴儿相比, 配方奶粉喂养的婴儿更容易患上传染性疾病, 如胃肠炎和急性中耳炎, 以及免疫介导性疾病, 如过敏等[9]。因此, 母乳化原料在婴幼儿配方奶粉中的使用尤为关键。母乳低聚糖在婴幼儿生长发育过程中有着十分重要的作用, 本文对HMOs的组成、结构进行介绍, 总结了添加母乳低聚糖的配方奶粉对婴幼儿健康影响的临床研究, 介绍了HMOs的合成和应用现状, 为新一代婴幼儿配方粉的设计提供思路和参考。

1 母乳低聚糖的组成和结构

HMOs是人类特有的一类未结合的、多功能的、不可消化的、结构多样的低聚糖[10]。HMOs约占母乳总碳水化合物含量的20%, 是仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分。HMOs在初乳中含量可达20～25 g/L, 并随着泌乳期的延长逐渐减少, 在成熟乳中含量约5～15 g/L[11]。与其他任何哺乳动物乳汁中的不同, 母乳中低聚糖的含量极高, 约为牛乳的1 000倍[12]。HMOs的含量以及多样性因母体遗传而异, 不同女性乳汁中HMOs的组成差异很大[13]。FUT2（Se）基因和FUT3（Le）基因均在母亲的乳腺上皮细胞中表达, 在HMOs岩藻糖基化过程中发挥关键作用[14]。FUT2（Se）基因的编码产物是α-1,2-L-岩藻糖转移酶[15], Se的酶主要在Ⅰ型糖链上合成H抗原。Ⅰ型糖链主要存在于分泌液中, 所以Se基因和产物决定了分泌与非分泌型[16]。FUT3（Le）基因的编码产物是α-（1,3/4）岩藻糖转移酶[17], 负责在Le前体（Lec）上合成Lea抗原或Leb抗原。如果是分泌型就合成Leb, 如果是非分泌型就合成Lea。根据FUT2和FUT3在乳腺组织中的表达方式, 可将母乳分为4类：Se+Le+, Se-Le+, Se+Le-, Se-Le-[18], 见表1。除了遗传因素外, 其他母体因素（如年龄、饮食或泌乳期）也会导致HMOs含量的不同[19-21]。

表1 Se和Le基因介导的不同母乳类型[18]

目前, 已经发现了200多种HMOs[23], 其中超过100多种的HMOs的结构已经被阐明[24-26], HMOs基本化学结构如图1所示。HMOs有5种基本的单糖组成, 分别是D-葡萄糖（Glucose, Glu）、D-半乳糖（Galactose, Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetylglucosamine, GlcNAc）、L-岩藻糖（Fucose, Fuc）和唾液酸（Sialic acid, Sia）[27]。所有的这些单糖通过不同的糖苷键与乳糖进行连接, 从而形成HMOs的不同结构。这些连接方式主要分为3种：（1）与α1-2、α1-3或α1-4连接的岩藻糖基；（2）乳糖-N-二糖和N-乙酰基乳糖胺单元（通过β1-3和β1-6键）进一步延长；（3）和/或通过α2-3或α2-6键连接在末端位置的唾液酸残基[28]。因此, 对应结构也分为3类, 岩藻糖基化低聚糖（35%～50%）、非岩藻糖基中性低聚糖（42%～55%）和唾液酸化低聚糖（12%～14%）[29]。部分HMOs按结构分类示例见表2。

图1 HMOs的基本化学结构组成[22]

表2 HMOs按结构分类示例表

2 母乳低聚糖对婴幼儿的健康影响

母乳低聚糖对婴幼儿的生长发育有着多种功能, 如抗病毒感染[30]、调节肠道菌群[31]、改善认知[32]等。但这些结果往往来自体外、动物或者母婴群组的关联研究, 需要更多的临床证据来揭示HMOs对婴幼儿的健康影响, 因此, 本文对添加HMOs的婴幼儿配方奶粉的临床研究主要结果进行汇总, 添加HMOs的婴幼儿配方奶粉安全性、耐受性良好, 在婴幼儿生长发育方面更贴近母乳喂养的婴幼儿, 且对免疫、肠道等方面有一定的积极影响。

2.1 生长发育

Marriage等[33]开展了一项在健康足月婴儿中进行的前瞻性、随机、对照、生长和耐受性研究。研究共纳入420名出生5天新生儿。试验分为4组, 母乳组采用纯母乳喂养, 对照组服用未添加HMOs的配方奶粉, 实验组1服用添加0.2 g/L 2’-FL的配方奶粉, 实验组2服用添加1.0 g/L 2'-FL的配方奶粉, 3组配方奶粉总寡糖含量均为2.4 g/L。结果显示, 各组之间在体重、身长和头围方面不存在显著性差异。通过大便次数, 大便稠度以及与进食相关的呕吐的发生率等指标进行评价, 3组配方奶粉均显示出良好的耐受性。进一步对血液中2'-FL的水平进行测定, 母乳组含量最高, 其次是实验组2、实验组1, 对照组未检测到2'-FL。且母乳组与实验组2'-FL相对吸收和排泄没有显著性差异。研究过程中的不良事件均由父母报告且经医生证实。对照组湿疹发生率明显高于两个实验组。

Kajzer等[34]开展了一项前瞻性、随机、多中心、双盲、对照、耐受性试验。试验纳入131名健康足月婴儿, 分为3组, 对照组服用不添加低聚糖的配方奶粉, 实验组服用0.2 g/L 2'-FL和2 g/L scFOS的配方奶粉, 母乳组进行纯母乳喂养。结果显示, 含有2'-FL和scFOS的配方奶粉安全且耐受良好。3组婴儿在35日龄时的粪便稠度、配方奶粉摄入量、人体测量学指标、与进食相关的呕吐等方面均不存在显著性差异。母乳组婴儿每天的粪便量比配方奶粉组更大。

Berseth等[35]开展了一项前瞻性、多中心、单臂研究。试验纳入59名健康的非常挑剔的足月婴儿。非常挑剔指由父母判断宝宝存在严重的烦躁和胀气的现象。试验周期28 d。结果显示, 含有2'-FL的配方食品安全且耐受性良好。父母报告说, 在改用含2'-FL的配方奶粉1 d后, 挑剔的婴儿的烦躁, 不安, 哭泣的小时数和呕吐的次数降低了, 在整个28 d的研究中一直保持这种状态。

Ramirez-Farias等[36]开展了一项前瞻性、单臂、非随机、多中心研究。试验纳入48名年龄小于60 d、既往病史和临床症状导致其服用低致敏性深度水解配方奶粉的婴儿。试验周期60 d。结果显示, 婴儿年龄的体重z得分有显著性的改善（60 d变化的平均值±标准误, 0.32±0.11, P=0.0078）。添加2'-FL的研究配方在受试人群中具有良好的安全性、耐受性。

2.2 免疫?

HMOs可以调节淋巴细胞细胞因子的产生, 可能介导Th1/Th2反应更平衡, 此外, 还可以减少免疫系统中选择素介导的细胞间相互作用, 减少白细胞在活化的内皮细胞上滚动, 可能导致黏膜白细胞浸润和活化减少, 从而发挥免疫作用[6]。

Goehring等[37]开展了一项前瞻性、随机、对照、生长和耐受性研究。试验纳入210名健康足月婴儿, 分组情况与Marriage等[33]研究相同。在6周龄时, 采集受试者血液样本, 进行10种细胞因子的检测。结果显示, 对照组受试者血液白细胞介素IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α浓度显著高于母乳组和2'-FL的配方奶粉组。2'-FL的配方奶粉组婴儿10种炎症因子与母乳喂养的婴儿没有显著性差异。此外, 研究者从婴儿血液中分离出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）进行细胞表型分析。在体外用呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）刺激PBMCs后, 研究TNF-α和IL-6水平的变化, 这两种细胞因子的表达可能与RSV感染的严重程度相关。结果显示, 添加0.2 g/L 2'-FL配方奶粉组TNF-α和IL-6水平与母乳喂养组水平相近, 显著低于对照组。添加1.0 g/L 2'-FL的配方奶粉组与其他3组均无差异。

Puccio等[38]开展了一项多中心, 随机, 双盲试验。试验纳入175名≤14 d日龄的健康足月婴儿, 分为两组, 实验组服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT配方奶粉, 对照组服用未添加HMOs的配方奶粉直至6月龄, 后续两组均服用未添加HMOs的2段配方奶粉至12月龄, 在婴儿1、2、3、4、6和12月龄时进行随访。结果显示, 与对照组相比, 在2个月时实验组受试者的大便更软（P=0.021）, 夜间醒来次数较少（P=0.036）。并且发现实验组婴儿呼吸道相关疾病的发病率较低, 发病率即为本组父母报告的发病人数/本组总人数, 包括以下几个方面：支气管炎发生率显著较低（P=0.004-0.047）, 分别为0～4个月时实验组2.3%和对照组12.6%, 0～6个月时实验组6.8%和对照组21.8%以及0～12个月时实验组10.2%和对照组27.6%；0～12月下呼吸道感染发生率降低（实验组19.3% vs对照组34.5%）；0～4个月使用退烧药次数下降（实验组15.9%vs对照组29.9%）；0～6个月（实验组34.1% vs对照组49.4%）和0～12个月（实验组42.0% vs对照组60.9%）使用抗生素次数下降。

此外, 体外研究表明, HMOs可以通过减少抗原抗体复合物诱导的趋化因子释放, 调节与过敏性疾病相关的人类上皮细胞反应[39]。Castillo-Courtade等[40]研究了口服2'-FL和6'-SL对卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的致敏小鼠过敏症状的影响。2'-FL和6'-SL通过诱导IL-10+T调节细胞和间接稳定肥大细胞来减轻食物过敏的症状。因此, HMOs可能对过敏性疾病有治疗潜力。Nowak-Wegrzyn等[41]通过人群试验进行了验证。试验研究了2'-FL和LNnT对牛乳蛋白过敏症（cow's milk protein allergy, CMPA）婴幼儿的影响。共纳入82名患有CMPA的婴幼儿, 分为两组, 对照组服用广泛水解乳清配方粉, 实验组服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT的广泛水解乳清配方粉。结果显示, 2'-FL和LNnT对患有CMPA的婴幼儿耐受性良好, 可推荐用于治疗婴幼儿CMPA。

2.3 肠道

HMOs可以改善婴幼儿的排便情况。Parschat等[42]进行了一次多中心、随机、对照、平行的临床研究, 评估含有5种HMO的配方对健康婴儿的安全性、耐受性以及生长发育的影响。实验纳入341名年龄≤14 d的受试者, 实验分为3组, 对照组喂养不添加HMOs的配方奶粉（n=112）, 实验组喂养含5种HMOs的配方奶粉（HMOs总含量5.75 g/L, 其中52% 2’-FL,13%3-FL,26% LNT,4% 3’-SL,5% 6’-SL；n=113）, 母乳组进行纯母乳喂养（n=116）, 试验周期4个月。配方奶粉组在体重、身高或头围方面没有显著性差异。实验组胃肠道耐受性较好, 且与对照组相比, 实验组和母乳喂养婴儿的粪便更软, 在4个月时, 实验组和母乳喂养组受试者排便次数更高（P=0.0428和P=0.0136）。

HMOs可以调节生命早期肠道菌群, 使其更贴近母乳喂养的婴幼儿, 为婴儿提供健康益处。Berger等[43]通过16S rRNA基因测序分析了添加2'-FL和LNnT对婴儿肠道菌群的影响。试验分为3组, 对照组服用未添加HMOs的配方奶粉, 实验组服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT的配方奶粉, 母乳组采用纯母乳喂养。研究将婴儿3个月和12个月的肠道菌群分析结果分为7种粪便群落类型。3个月时, 3组的菌群在属水平上具有显著差异；与对照组相比, 实验组的菌群组成更接近于母乳组。顺产和剖腹产婴儿中, 实验组与母乳组之间的菌群差异无显著性；然而分娩方式对对照组的菌群有明显影响, 表明HMOs补充对剖腹产婴儿更有效应, 使其更贴近顺产婴儿。12个月时, 两种配方奶粉组的菌群组成无显著差异。

3 母乳低聚糖的合成及应用

HMOs的生产技术大致可以分为3类：天然提取, 化学合成和生物合成[44]。早期HMOs是从母乳中提取出来的, 该方法可以保留HMOs的天然结构不被破坏, 但由于缺乏足够的捐赠母乳, 无法实现产业化。此外, 牛羊乳中也存在低聚糖, 但成分及含量与母乳相差甚远, 产量低且成本极高。化学合成方法能够合成我们所需要的特定结构的HMOs, 特别是在合成结构复杂、分支多的HMOs时具有优越性。但是, HMOs的化学合成过程存在许多问题, 如糖苷键形成的立体和区域选择性控制的不准确, 多个活化、保护和脱保护步骤的复杂性使工业化生产具有诸多挑战, 同时, HMOs得率低, 生产成本高[45]。

生物合成主要是通过酶法或微生物合成的方法产生, 具有生产成本低、环境污染小等优势, 但同样也面临安全性的顾虑和法规的限制。酶法可以增加化学合成的结构多样性, 但获得在体外仍然具有高效的酶是困难的, 在体外反应中还会受到酶本身性质的限制[46]。近年来, 微生物合成法逐渐成为HMOs商业化生产的主要方式[47-48], 实现了HMOs的大规模生产。微生物合成法往往通过利用其自身或分子生物学技术在宿主菌株中引入必要的代谢基因, 如乳糖渗透酶和合适的糖基转移酶, 并去除不利的代谢基因, 如影响转基因生物合成前体的结肠酸代谢途径, 从而代谢产生HMOs。利用全细胞反应增加了系统的复杂性且有时会存在某些副反应消耗底物或产物, 从而影响HMOs的产率。同时从细菌细胞内以及细菌培养物中进行产物分离要比从体外酶反应体系中分离复杂得多[49]。目前常用的宿主菌株包括大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌, 见表3。其中, 大肠杆菌因其引入DNA分子有效性强、表达水平高和生长快速等优点而被广泛应用于生产HMOs[50]。

表3 微生物合成法生产HMOs

虽然这些合成的HMOs与天然结构相同, 但这些成分的引入仍需得到世界上不同管理部门的评估和批准[60]。2015年, Glycom A/S通过化学合成法生产的2'-FL和LNnT首次获得美国食品药品管理局（Food and Drug Administration, FDA）的GRAS认证。随着监管和法规进程的推进, 目前已有来自不同制造商的7种HMOs通过了GRAS认证, 见表4, 可以预计未来会有越来越多的HMOs通过监管许可, HMOs市场也会越来越大。目前, 雅培、雀巢、惠氏等外资品牌也相继推出了添加HMO的产品。且除了婴幼儿产品外, 一些成人产品也开始添加HMO。

表4 美国FDA GRAS认证的HMOs

（续表4）

4 展望

随着生物技术的发展, 越来越多的HMOs实现了工业化的生产。目前, 我国尚未批准HMOs在婴幼儿配方食品中的使用, 但在美国、欧洲等国家, HMOs已经被批准在婴幼儿食品中进行添加, 并且通过一系列的临床试验验证, 这些添加HMOs的奶粉在安全性、耐受性、增强免疫、抗感染、缓解过敏、促进肠道健康等诸多方面也表现出有益效果。因此, HMOs有着良好的应用前景。但HMOs种类多样, 不同的国家人群、基因型等都对其含量存在影响, 并且仅在配方奶粉中引入一个或更多个HMOs不足以完全模拟与母乳成分的复杂性相关的所有有益效果, 因此, 仍需要大量、深度的研究, 尤其是对中国人群母乳中独特的HMOs含量以及临床等研究, 为婴幼儿配方食品的母乳化提供科学、合理的证据。