外生菌根真菌对薄壳山核桃幼苗生长的影响

张仕杰 陈鑫林 陈 于 白晓倩 赵玉强 王 武 朱灿灿* 陆小美

（1江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014；2常州果美农业科技有限公司，江苏常州 213245）

薄壳山核桃（Carya illinoinensis（Wangehn.） K.Koch）为胡桃科山核桃属植物，原产美国和墨西哥，是世界上重要的油料干果树种之一，极具经济价值和开发潜力[1]。目前，我国已在江苏、安徽、浙江、云南等省大面积推广种植薄壳山核桃[2]。随着薄壳山核桃种植面积的不断增加，种植园肥水管理等技术滞后，出现了果园低产、经济效益差等制约薄壳山核桃产业发展的瓶颈问题[3]。从高效、环保、节约成本的角度出发实施科学合理施肥，提高肥料利用效率，促进薄壳山核桃快速生长，提高产量，是目前薄壳山核桃生产亟待解决的问题[4]。利用促进植物营养高效吸收的微生物进行生物施肥，是改善过量施肥造成的土壤环境恶化问题的最可行途径，也是现代农业科技研究领域的热点[5]。

薄壳山核桃可与多种外生菌根真菌形成共生关系[6]。菌根是普遍存在于植物根系和土壤真菌之间的互惠共生体，两者在长期共生过程中互利共生、协同进化[7]。菌根共生的最普遍类别之一是外生菌根，外生菌根真菌在增强树木根系对水分及氮、磷等矿质元素的吸收、改良土壤结构、提高抗逆性和生产力等方面具有重要作用[8]。

有研究表明，外生菌根真菌接种结合氮磷钾施肥有利于薄壳山核桃树体生长以及薄壳山核桃结实率的提高[9]。通过对感染腐霉菌根腐病的薄壳山核桃根部接种大孢硬皮马勃菌，发现根部腐霉菌数量明显减少[10]。因此，外生菌根在促进薄壳山核桃生长发育和提高抗逆性方面具有重要作用。目前，外生菌根真菌对薄壳山桃生长的影响研究仍存在较大不足。因此，本研究以薄壳山核桃实生苗为试验对象，探讨外生菌根真菌接种对薄壳山核桃幼苗生长的影响，以期为利用外生菌根真菌提高薄壳山核桃生长树势、促进薄壳山核桃增产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

薄壳山核桃波尼品种的种子经萌发、生长至子叶期（苗龄45 d）移入根箱进行外生菌根真菌接种。接种方法参考Zhang等[11]的方法，即将薄壳山核桃幼苗移栽于根际盒中，然后将新鲜并具活力的菌丝块（2cm×2cm）贴于薄壳山核桃幼苗根系进行接种培养。对照苗用无菌琼脂块代替。所有幼苗均在气候培养箱中培养（16 h，25℃光照培养；8 h，23℃黑暗培养）。

供试外生菌根菌株为本实验室保存的外生菌根真菌土生空团菌（Cenococcum geophilum，Cg）和豆马勃属（Pisolithus sp.，PS）。外生菌根真菌菌丝保存在MMN培养基中[11]，25℃黑暗培养。

1.2 试验设计

薄壳山核桃外生菌根苗（成功接种菌种Cg和PS，3个月苗龄）以及对照苗（3个月苗龄）被用于后续试验。采用盆栽试验（盆高16 cm，直径18 cm），设置未接种的对照组和接种外生菌根真菌Cg和PS的处理组。每盆移栽1株苗，各处理分别重复3盆。培养基质（蛭石和珍珠岩的混合物、田园土壤、草炭按3∶2∶1混合，每盆 1 200 g）经过高压灭菌（121 ℃，180 min）。盆栽苗培养在半封闭避雨设施场地内，每隔3～4 d用自来水浇灌1次（达到田间最大持水量）。植株经6个月生长后测定光合指标，然后收获，分别测定薄壳山核桃幼苗叶片含水率，地上茎、干样重量，地下菌根侵染率和根系的干样重量。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 光合指标。利用LI-6800光合-荧光测量系统（美国LI-COR公司），于幼苗收获前的晴朗天气，分别测定对照区和菌根处理区植株的光合性能参数，测定环境为试验基地自然环境，选择荧光叶室（叶室面积 2×3 cm2），气体流速为 500 μmol/s，湿度控制为55%，采用CO2钢瓶将CO2浓度控制为400μmol/mol，测定叶室温度控制为28℃，测定光照度设置为1 500 μmol/（m2·s）。 测定时间为上午 8：30—11：30。每株幼苗选择长势良好且具有代表性的叶片3片进行测定，然后求其平均值。测定参数包括净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、胞间 CO2浓度（Ci）及气孔导度（Gsw）。

参考陈雅琦等[12]的公式计算气孔限制值（Ls），计算公式如下：

式中，Ca为大气CO2浓度，本研究CO2浓度控制为 400 μmol/mol。

参考邹英武等[13]的公式计算水分利用率（WUE）。计算公式如下：

1.3.2 地上生物量。将收获的薄壳山核桃幼苗地上部和地下部分开，待地上部叶片鲜重测定后，将地上茎叶放入烘箱（60℃），干燥48 h后测定干重。叶片含水率计算公式如下：

叶片含水率（%）=（叶片鲜重-叶片干重）/叶片鲜重×100

1.3.3 地下生物量。分别随机选取对照和外生菌根真菌侵染苗的10条侧根，在体式显微镜下（光学显微镜LIOO SZ850）进行菌根的观察计数（平均计数根尖1 200个左右）。菌根计数观察后，将地下根系60℃干燥48 h后确定地下根系干重。菌根侵染率计算公式如下：

1.4 数据分析

采用Excel 365和R 4.0.2（Window 10 64位）对数据进行处理分析，采用配对t检验法进行差异显著性（P<0.05）检验，P值采用Benjamini-Hochberg法进行矫正。采用GraphPad Prism 8绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 接种外生菌根真菌对薄壳山核桃光合作用的影响

由表1可知，与对照相比，接种外生菌根处理的薄壳山核桃幼苗净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gsw）均显著提高（P<0.05），但胞间 CO2浓度（Ci）无显著差异。 水分利用效率（WUE）方面，虽然在数值上高于对照，但没有统计学差异，气孔限制值（Ls）在数值上虽然低于对照，但也无统计学差异。

表1 不同处理薄壳山核桃幼苗光合特性参数

2.2 接种外生菌根真菌对薄壳山核桃幼苗生物量的影响

由图1可知，相较于对照，接种外生菌根处理可显著提高薄壳山核桃幼苗的地上茎叶干重和叶片含水率。其中，Cg接种处理地下根系干重和植株地径也显著高于对照和PS接种处理（P<0.05）。由图2可知，PS接种处理根冠比显著低于Cg接种处理和对照。由此说明，不同外生菌根真菌对根系生长的影响存在差异。

2.3 不同菌种菌根侵染率

显微镜下检测显示，所有未接种的对照盆中均没有发现菌根。接种处理的根系均观察到典型的外生菌根外观形态结构。PS接种处理菌根侵染率（65.5%）显著高于Cg接种处理菌根侵染率（28.1%）（P<0.05）。通过观察发现，PS接种处理菌根主要形成于幼嫩新根处，并且附着大量的根外菌丝以及菌索；Cg接种处理菌根主要形成于老根处，根外菌丝呈头发状稀疏发散，但没有PS接种处理丰富。

3 结论与讨论

薄壳山核桃是重要的经济林树种，也是典型的外生菌根真菌共生树种[6]。菌根真菌是陆地生态系统中重要的功能菌群之一，外生菌根真菌在森林生态系统中分布极其广泛，它们可通过促进宿主植物对土壤矿质营养元素和水分等的吸收来促进宿主植物生长发育，同时提高植物抗旱、抗盐胁迫的能力[7，14]。本研究通过在薄壳山核桃幼苗根系上接种外生菌根真菌，结果表明，外生菌根真菌对薄壳山核桃幼苗生长有不同程度的促进作用，这和外生菌根真菌在其他树种上的研究结果一致[11，15]。但何种菌根真菌与薄壳山核桃是最佳组合，以及最优外生菌根真菌的筛选还有待进一步试验研究。本试验结果表明，菌根侵染率较低的Cg接种处理反而可显著提高宿主薄壳山核桃幼苗地上生物量，地下根系生物量也显著高于对照苗和PS接种苗，表明不同外生菌根真菌菌种的促生特性存在差异。外生菌根植物的资源交换被认为发生在菌体与植物的界面上，而资源交换是促使菌根植物生长的主要原因。但一些研究结果表明，越来越多这种强化植物生长，特别是根系生长的促进，可能与根系定植率无关。Szuba等[16]研究表明，尽管根定植率很低（2.1%±0.3%），外生菌根真菌卷缘桩菇（Paxillus involutus）仍显著促进了白杨（Populus×canescens）的生长。不同外生菌根真菌为宿主提供营养的能力可能会有所不同，目前已经明确外生菌根真菌在吸收氮和磷的能力上有很大差异[17]。外生菌根的功能多样性及其深层次的作用机制还有待进一步研究。深入研究不同菌种对薄壳山核桃生长发育的影响及其作用机制，将会成为后续薄壳山核桃菌根研究的一个重要方向，也为利用外生菌根真菌促进薄壳山核桃产业绿色生态优质发展提供理论依据。