lncRNA AC131056.3通过调控miR-21-5p对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响

牟健雄,丁崇军,唐荣慧,叶勇衡,谢 琳,李 衡

(1 四川省西昌市人民医院骨科,西昌 615000;2 昆明医科大学第一附属医院骨科;* 通讯作者,E-mail:mjxzj820112@163.com)

骨肉瘤是骨肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，严重威胁青少年生命健康[1]。骨肉瘤对放疗和化疗均不敏感，临床治疗效果很差[2]。阐明骨肉瘤的发病机制对基因治疗新靶点的发现具有重要意义。

人类基因组转录产物中只有一小部分是具有编码能力的RNA，绝大部分是非编码RNA，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是非编码RNA最重要的组成部分[3,4]。近年来研究发现，lncRNA虽然没有开放阅读框，但其对肿瘤细胞的恶性表型具有重要的调节作用，lncRNA异常表达能够显著影响肿瘤细胞的放疗敏感性和化疗敏感性[5-7]。AC131056.3是最新发现的一种lncRNA，其长度为486个核苷酸，AC131056.3在帕金森病患者血液白细胞中的表达异常，可能与帕金森病的发病有关[8]。目前国内外对AC131056.3在肿瘤中的表达和功能研究很少。LOGpc数据库分析显示，AC131056.3高表达的骨肉瘤患者总生存期明显长于AC131056.3低表达的患者，AC131056.3可能参与调控骨肉瘤细胞的恶性行为。本研究通过观察AC131056.3在骨肉瘤细胞系中的表达，AC131056.3对骨肉瘤细胞增殖和侵袭活力的影响，探究AC131056.3是否通过靶向miR-21-5p发挥作用，AC131056.3的作用机制研究可能为骨肉瘤治疗提供新的分子靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞株与试剂

正常成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS，均购自中国科学院上海细胞库。逆转录试剂盒、CCK-8试剂盒、qRT-PCR试剂盒，均购自大连宝生物公司。RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基和胎牛血清购自日本TaKaRa公司。pcDNA质粒、pcDNA-AC131056.3质粒、miR-NC mimic、miR-21-5p mimic、双荧光素酶报告基因载体WT-AC131056.3、MUT-AC131056.3购自北京索莱宝公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒、Lipofectamine 2000试剂盒购自上海吉玛生物制药有限公司。Transwell小室和基质胶购自美国Promega公司。抗p-Akt、p-mTOR、β-Tubulin、p-PI3K、GSK-3、PDK-1抗体及辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗购自美国BD公司。

1.2 细胞培养和转染

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基分别培养hFOB1.19、Saos2、U-2OS、MG-63细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养143B、HOS细胞，培养参数为37 ℃、5%CO2。将对数生长期的HOS细胞以每孔5×104个接种6孔板，培养48 h，采用Lipofectamine 2000脂质转染法，分别将pcDNA质粒、pcDNA-AC131056.3质粒转染HOS细胞，命名为对照组和AC131056.3组。培养48 h后，qRT-PCR检测两组HOS细胞中AC131056.3表达。

1.3 生物信息学分析

采用GEPIA数据库分析骨肉瘤患者总生存期和AC131056.3表达的相关性。采用DIANA-LncBase v3网站预测AC131056.3能够互补结合的微小RNA(miRNA)。

1.4 qRT-PCR检测对照组和AC131056.3组HOS细胞中AC131056.3和miR-21-5p的表达

用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，定量RNA浓度和纯度后逆转录，将得到的cDNA进行qRT-PCR检测。反应条件为：97 ℃预变性4 min；97 ℃变性20 s，61 ℃退火27 s，71 ℃延伸27 s，共31次循环。AC131056.3上游引物为5′-CATGGAATTTTGTCGGTTCA-3′，下游引物为5′-TCAGTTTGCAAGAGGCAGAA-3′；miR-21-5p上游引物为5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，下游引物为5′-AACTCAAGGTTCTTCCAGTCACG-3′；GAPDH上游引物为5′-GCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物为5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAG-3′；U48上游引物为5′-TGACCCCAGGTAACTCTGAGTGTGT-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt方法计算AC131056.3相对GAPDH的表达以及miR-21-5p相对U48的表达。

1.5 CCK-8法检测HOS细胞增殖活性

将对照组和AC131056.3组HOS细胞(4×103/孔)接种于96孔板，每组4个平行孔。培养箱中分别培养1，2，3，4，5 d。CCK-8实验检测时，每孔加CCK-8试剂40 μl，继续培养4 h，多功能酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值(A)，A值越高说明增殖活性越强。

1.6 Transwell实验检测HOS细胞侵袭活力

在Transwell上室滴加基质胶，培养箱内凝固为胶体。将转染后的HOS细胞(对照组和AC131056.3组)，以每孔4×104个接种至Transwell上室，给Transwell下室加入含10%胎牛血清的培养基700 μl，培养24 h后，弃去培养基，加入8%多聚甲醛固定60 min，加入2%结晶紫染色60 min，清水清洗，倒置显微镜下观察，统计细胞侵袭数。

1.7 双荧光素酶报告基因验证AC131056.3与miR-21-5p的结合

将HOS细胞接种在新的6孔板，培养48 h后更换为不含胎牛血清的培养基，采用Lipofectamine 2000脂质转染法，分别共转染miR-21-5p mimic与WT-AC131056.3或MUT-AC131056.3、miR-NC mimic与WT-AC131056.3或MUT-AC131056.3，每组4个平行孔。培养48 h后裂解细胞，离心取上清，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶荧光强度和海肾荧光素酶荧光强度，两者荧光强度比值即相对荧光素酶活性。

1.8 Western blot法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白p-Akt、p-mTOR、p-PI3K、GSK-3、PDK-1表达

在RIPA裂解液中按照100∶1的比例加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，裂解对照组和AC131056.3组HOS细胞，在SDS-PAGE凝胶中电泳，通过聚偏二氟乙烯膜转膜。12%脱脂牛奶封闭后，加一抗工作液，稀释度分别为p-Akt(1∶3 000)、p-mTOR(1∶2 000)、p-PI3K(1∶2 000)、GSK-3(1∶1 000)、PDK-1(1∶2 000)，4 ℃孵育14 h。回收一抗，滴加山羊抗鼠二抗，室温孵育4 h。通过凝胶成像分析仪采集各个蛋白的条带结果，以β-Tubulin为内参照。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 AC131056.3表达水平与骨肉瘤患者总生存期的关系

GEPIA数据库分析显示，骨肉瘤组织中AC131056.3高表达的骨肉瘤患者的总生存期高于低表达患者，差异具有统计学意义(P<0.01，见图1)。

图1 AC131056.3表达水平与骨肉瘤患者总生存期的关系Figure 1 Relationship between the expression level of AC131056.3 and the overall survival of patients with osteosarcoma

2.2 AC131056.3在骨肉瘤细胞系中的表达水平

qRT-PCR检测结果显示，正常成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS中AC131056.3相对表达分别为1.02±0.19，0.55±0.12，0.30±0.05，0.71±0.11，0.66±0.07和0.12±0.05。与正常成骨细胞比较，骨肉瘤细胞系中AC131056.3表达均下降(P<0.05)，其中HOS细胞中AC131056.3的表达最低(P<0.01，见图2)。

与hFOB1.19细胞相比，* P <0.05，* * P <0.01

2.3 转染pcDNA-AC131056.3质粒对HOS细胞AC131056.3表达的影响

qRT-PCR检测显示，转染pcDNA-AC131056.3质粒后，AC131056.3组和对照组HOS细胞中AC131056.3相对表达分别为10.69±3.16和1.07 ±0.22，差异具有统计学意义(t=6.09，P<0.01)，表明过表达AC131056.3的HOS细胞构建成功。

2.4 过表达AC131056.3对HOS细胞增殖活力的影响

CCK-8法分别检测AC131056.3组和对照组HOS细胞的增殖活力，结果显示，与对照组比较，AC131056.3组HOS细胞在第2，3，4，5天的吸光度A值显著降低(P<0.05,见图3)，说明过表达AC131056.3可抑制HOS细胞的增殖活力。

与对照组比较，* P <0.05，* * P <0.01

2.5 过表达AC131056.3对HOS细胞侵袭活力的影响

Transwell实验显示，AC131056.3组和对照组HOS细胞侵袭数分别为(30.25 ±11.52)个和(68.54 ±14.81)个，差异有统计学意义(t=3.98，P<0.01，见图4)，说明过表达AC131056.3能抑制HOS细胞侵袭活力。

与对照组比较，* * P <0.01

2.6 生物信息学预测AC131056.3的靶基因

采用DIANA-LncBase v3网站预测显示，AC131056.3可能与miR-21-5p互补结合，结合位点和突变位点见图5。

图5 生物信息学网站预测AC131056.3的靶基因Figure 5 Prediction of the target gene of AC131056.3 by bioinformatics website

2.7 双荧光素酶报告基因法验证AC131056.3靶向miR-21-5p

双荧光素酶报告基因法显示，与共转染WT-AC131056.3+miR-NC mimic相比，共转染WT-AC131056.3+miR-21-5p mimic的HOS细胞荧光素酶活性明显降低(t=6.93，P<0.01)；与共转染MUT-AC131056.3+miR-NC mimic相比，共转染MUT-AC131056.3+miR-21-5p mimic的HOS细胞荧光素酶活性变化差异无统计学意义(t=0.90，P>0.05，见图6)，说明AC131056.3可靶向结合miR-21-5p。

与miR-NC比较，* * P <0.01

2.8 过表达AC131056.3对miR-21-5p表达的影响

qRT-PCR检测显示，对照组和AC131056.3组HOS细胞中miR-21-5p表达分别为1.05±0.28和0.21±0.05，差异有统计学意义(t=5.76，P<0.01)，说明过表达AC131056.3靶向下调miR-21-5p的表达。

2.9 过表达AC131056.3对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响

Western blot检测显示，与对照组相比，AC131056.3组PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、GSK-3、PDK-1表达显著降低(见图7)，说明过表达AC131056.3能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路转导。

图7 过表达AC131056.3对HOS细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响Figure 7 Effect of AC131056.3 overexpression on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway proteins in HOS cells

3 讨论

骨肉瘤是骨科常见的骨肿瘤，其早期症状不显著，确诊时已处于中晚期，骨肉瘤患者5年生存率很低[9]。长链非编码RNA(lncRNA)在表观遗传水平影响靶基因的转录、稳定、乙酰化修饰等过程，在细胞的生理和病理活动方面起到关键调控作用[10-12]。lncRNA被证实与肿瘤包括骨肉瘤的发生、进展具有相关性[13]。既往研究报道，lncRNA BCRT1在骨肉瘤组织标本和细胞系中显著上调，其表达升高诱导骨肉瘤细胞周期和增殖，促进细胞的上皮间充质转化和炎症介质的分泌[14]。与正常组织和细胞系相比，骨肉瘤组织和细胞系中的lncRNA TUSC7表达下调，lncRNA TUSC7过表达可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，在体外和体内促进骨肉瘤细胞的凋亡[15]。顺铂耐药细胞系中lncRNA FOXD2-AS1表达水平显著升高，敲除lncRNA FOXD2-AS1明显抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并加速骨肉瘤细胞的凋亡[16]。以上研究均提示lncRNA参与调节骨肉瘤的发生和发展，探究特异性表达的lncRNA可能为骨肉瘤的临床治疗提供新的靶点。

本研究通过检索GEPIA数据库显示，AC131056.3高表达的骨肉瘤患者总生存期明显长于AC131056.3低表达的患者，AC131056.3高表达的骨肉瘤患者预后较好，说明AC131056.3可能参与介导骨肉瘤的发生进展。国内外关于AC131056.3对骨肉瘤恶性生物学行为的影响尚未见报道。本研究结果证实，在骨肉瘤细胞Saos2、U-2OS、MG-63、143B、HOS中AC131056.3低表达，说明其可能发挥抑癌基因的角色。通过质粒转染过表达AC131056.3，细胞实验证实其过表达显著抑制HOS细胞的增殖和侵袭活力，确定了AC131056.3的抑癌基因属性。lncRNA主要作为竞争性内源RNA，通过吸附特定miRNA，减少其表达，从而参与疾病的病理进程[17]。例如lncRNA SOX21-AS1通过吸附miR-7-5p，负调控miR-7-5p的表达，从而促进骨肉瘤细胞的增殖和转移[18]。

本研究DIANA-LncBase v3网站预测显示，AC131056.3可能靶向调控miR-21-5p。研究显示，miR-21-5p在肺癌、卵巢癌、食管癌等肿瘤组织和细胞系中高表达，能够促进肿瘤细胞的增殖、转移，抑制细胞的自噬和凋亡，与肿瘤的淋巴结转移、组织学分级、预后恶化相关[19-22]。miR-21-5p在骨肉瘤组织和细胞系中显著高表达，在骨肉瘤细胞中扮演原癌基因的角色，显著促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭速率[23,24]。经双荧光素酶报告基因法证实，AC131056.3与miR-21-5p确实存在相互结合位点。同时，过表达AC131056.3后，HOS细胞中miR-21-5p表达显著降低，证明miR-21-5p表达受AC131056.3调控。miR-21-5p促进骨肉瘤细胞和侵袭是通过正调控PI3K/Akt/mTOR信号通路表达实现[25]。本研究结果显示，HOS细胞中过表达AC131056.3后，PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达明显降低，间接证明AC131056.3通过调控miR-21-5p表达发挥作用。

综上所述，骨肉瘤中AC131056.3高表达的患者总生存期高于低表达患者，骨肉瘤细胞系中AC131056.3显著低表达，上调AC131056.3通过负向调控miR-21-5p表达，影响PI3K/Akt/mTOR信号通路转导，显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。AC131056.3/miR-21-5p分子轴可能为骨肉瘤治疗提供了新的靶点。