EPAS1 siRNA抑制人肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC的增殖、迁移及侵袭

陈海滨，赵建军，谭 超

(河北工程大学附属医院 泌尿外二科, 河北 邯郸 056004)

肾细胞癌是常见泌尿系统恶性肿瘤之一，具有高发病率、高致死率特点，其中70%左右患者为肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma)。肾透明细胞癌恶性程度较高，多数患者对放射治疗和化学药物治疗(简称放化疗)、激素治疗等不敏感，预后效果不佳[1-2]。故而，探究肾透明细胞癌发病机制并发现其生物治疗靶标，对于改善患者预后意义重大。内皮PAS区域蛋白1(endothelial PAS domain-containing protein 1，EPAS1)作为转录因子，在细胞应对缺氧时发挥关键作用，与肿瘤发生发展有关[3-4]。目前有关EPAS1 siRNA对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响鲜有报道，因此本研究以人肾透明细胞癌HiMet-ccRCC为研究对象，采用RNA干扰技术观察EPAS1对肾透明细胞癌HiMet-ccRCC细胞生物学行为的影响。

1 材料及方法

1.1 材料与试剂

人肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC(北京北纳创联生物技术研究院)；MEM-EBSS培养基(Hyclone公司)；LipofectamineTM3000试剂盒(上海吉雅生物科技有限公司)；EPAS1 siRNA、non-target siRNA及引物序列(上海生工公司)，其中EPAS1 siRNA序列为：正义链：5′-AATTCCACTTGATGCC ATAGGCCTGTCTC-3′和反义链：5′-AACCTATGGC ATCAAGTGGAACCTGTCTC-3′，non-target siRNA序列为：正义链：5′-AAATACAGGGTGGTGTTCCAGC CTGTCTC-3′和反义链：5′-AACTGGAACACCACCCT GTATCCTGTCTC-3′，序列带有FITC标记，以便鉴定转染效率；Matrigel基质胶(北京泽平科技有限公司)；3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(Sigma-Aldrich公司)；兔源E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、PCNA、GAPDH一抗及对应二抗(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：取HiMet-ccRCC细胞并将其复苏，培养于含10%灭活FBS+MEM-EBSS培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞增长良好且达对数增长期时进行后续实验。

将HiMet-ccRCC细胞重悬后接种于24孔板(2.5×105个/孔)；对细胞进行转染，细胞分组：1)对照(control，Con)组；2)阴性对照(negative control，NC)组：加入5 μL Lipofectamine3000和50 pmol/μL国际通用的与所有基因均无同源性序列的non-target siRNA[5]；3)沉默EPAS1表达组(EPAS1 siRNA组)：加入5 μL Lipofectamine3000和50 pmol/μL EPAS1 siRNA，每组6个复孔。转染24 h后进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR检测各组细胞EPAS1 mRNA表达[6]：各组HiMet-ccRCC细胞使用Trizol试剂进行总RNA提取，测定RNA质量及浓度后将其反转录合成cDNA，然后将2.0 μL cDNA、各2.0 μL上下游引物(表1)、10 μL ULtraSYBR mixture与4.0 μL ddH2O混匀制备反应体系，随后置于荧光定量PCR仪上扩增[设定程序为93 ℃ 30 s，(93 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s)×40个循环]。以GAPDH为内参，以2-△△Ct法计算EPAS1 mRNA含量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 MTT法检测HiMet-ccRCC细胞增殖能力：将转染24 h后的各组HiMet-ccRCC细胞接种于96孔板(5×103个/孔，100 μL)，分别于培养0、24、48 h后向各孔中加入20 μL MTT溶液(5 ng/mL)，继续培养4 h后弃去上清，添加150 μL DMSO溶解结晶。用FC酶标仪测定各孔细胞在490 nm处的吸光度值(A490 nm)，并计算细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A490 nm/对照组A490 nm)×100%。

1.2.4 Transwell小室法测定细胞侵袭、迁移能力：1)细胞侵袭：以不含胎牛血清的MEM-EBSS培养基重悬细胞，按3×103个/孔(200 μL)加入到Transwell小室上层(Transwell小室上层经50 μL 2.0 mg/mL液态Matrigel基质胶预包被)，500 μL含10%胎牛血清的MEM-EBSS培养基加入下层，24 h后取出小室，轻轻擦去Matrigel基质胶及上层残留细胞，冲洗后甲醛固定、结晶紫染色。封片后显微镜下观察染色细胞并拍照，随机选6个视野，统计各组细胞侵袭数(Image J软件)，取均值。2)细胞迁移：不需要铺胶，其余操作步骤同细胞侵袭实验。

1.2.5 免疫印迹法检测增殖、侵袭、迁移相关蛋白表达：收集并裂解转染24 h后的各组HiMet-ccRCC细胞以提取总蛋白，并参照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白浓度，各样品取30 μg变性的蛋白进行12% SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜，封闭(5%脱脂奶粉)2 h后加入一抗(E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、PCNA、GAPDH，1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(HRP标记山羊抗兔，1∶1 000稀释)，室温孵育2 h。显色、曝光，采用Image J软件定量蛋白。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 稳定转染细胞系鉴定

EPAS1 siRNA组细胞转染效果，在镜下均可见绿色荧光，HiMet-ccRCC细胞成功转染non-target siRNA、EPAS1(图1)。

left.cell morphology in bright field; right.cell fluorescence (green fluorescence)图1 荧光显微镜检测NC组、EPAS1 siRNA组转染情况Fig 1 Detection of siRNA transfection in NC group and EPAS1 group by fluorescence microscope(×200)

2.2 RT-qPCR检测HiMet-ccRCC细胞EPAS1 mRNA表达

EPAS1 siRNA组细胞EPAS1 mRNA表达水平明显低于对照组、阴性对照组(P<0.05)(表2)。

表2 HiMet-ccRCC细胞EPAS1 mRNA表达水平

2.3 MTT法检测HiMet-ccRCC细胞增殖

与对照组、阴性对照组比较，24或48 h后EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)，由于48 h细胞增殖抑制率升高更为明显，因此后续实验选择48 h进行后续实验(表3)。

表3 HiMet-ccRCC细胞增殖情况比较

2.4 各组HiMet-ccRCC细胞侵袭及迁移情况比较

与对照组、阴性对照组比较，EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞迁移数、侵袭数均显著减少(P<0.05)(图2～3，表4)。

2.5 蛋白质印迹法检测增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

与对照组、阴性对照组比较，EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞中E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)，N-cadherin、MMP-9、PCNA蛋白表达下调(P<0.05)(图4，表5)。

图2 HiMet-ccRCC细胞迁移情况比较Fig 2 Comparison of migration of HiMet-ccRCC cells (×200)

图3 各组HiMet-ccRCC细胞侵袭情况比较Fig 3 Comparison of invasion of HiMet-ccRCC cells in each group (×200)

表4 各组HiMet-ccRCC细胞迁移及侵袭情况比较

图4 Western blot检测各组HiMet-ccRCC细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白Fig 4 Western blot diagram of proliferation, migration and invasion related proteins of HiMet-ccRCC cells in each group

3 讨论

EPAS1是细胞应对低氧环境的关键转录因子，与血管生成及肿瘤发生关系密切[7]。研究显示，EPAS1rs11894252位点基因多态性与肾透明细胞癌发生有关，且可作为肾透明细胞癌预后标志物[8]。既往研究显示，在原发性和转移性肾透明细胞癌小鼠模型中注射新型EPAS1抑制剂PT2399可导致肿瘤消退[9]。抑制胰腺癌细胞中EPAS1基因表达，能够诱导胰腺癌细胞凋亡及抑制细胞增殖[10]。与正常对照组比较，肾透明细胞癌患者血清EPAS1水平升高，且与淋巴结转移有关，提示EPAS1异常高表达可能参与肾透明细胞癌发生发展过程[11]。非小细胞肺癌细胞PC14HM中敲低EPAS1可抑制体外细胞增殖和体内肿瘤生长，并抑制体内PC14HM细胞腹膜转移[12]。推测抑制EPAS1表达可明显抑制肾癌细胞活力，并促进细胞凋亡、降低肾癌细胞迁移、侵袭能力。本研究中随着培养时间的延长，EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞增殖抑制率明显升高，且在不同时间点EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞增殖抑制率高于对照组、阴性对照组；进一步实验发现，EPAS1 siRNA组HiMet-ccRCC细胞迁移、侵袭数高于对照组、阴性对照组，提示抑制EPAS1基因表达使肾透明细胞癌HiMet-ccRCC细胞增殖、迁移及侵袭等恶性行为得到一定控制。

PCNA可通过调节DNA复制、DNA修复等途径参与癌变过程，是一个促细胞增殖因子[13]。MMP-9作为基质金属蛋白酶家族分子质量最大的成员，通过降解、破坏细胞外基质成分在肿瘤转移过程中发挥重要作用[14]。以细胞黏附分子(如E-cadherin)表达减少、具有间质源性的N-cadherin等表达升高为主要特征的EMT是上皮细胞来源恶性肿瘤细胞获得转移能力的重要生物学过程，调控着癌细胞迁移、侵袭行为[15]。过表达冷诱导RNA结合蛋白可抑制肾癌细胞增殖及迁移，且肾癌细胞中N-cadherin表达明显降低，E-cadherin表达增高[16]。本结果显示，转染EPAS1 siRNA后，HiMet-ccRCC细胞中E-cadherin显著上调，N-cadherin、MMP-9、PCNA显著下调，表明沉默EPAS1抑制HiMet-ccRCC细胞增殖、迁移及侵袭可能与调控E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、PCNA表达有关。

表5 各组HiMet-ccRCC细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达比较

综上所述，沉默EPAS1可调控E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、PCNA表达，抑制HiMet-ccRCC细胞增殖、迁移及侵袭，提示EPAS1在肾透明细胞癌发生和进展中可能为肿瘤促进因子，有望成为肾透明细胞癌的潜在生物靶标。