蛇菰多糖减轻急性脊髓挫伤模型大鼠的神经元损伤

赵方毓，覃晓莉，何一多，王凤杰，唐鲜娥，彭新鑫，陈显兵*

(1.湖北民族大学附属民大医院 病理科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大学 医学部， 湖北 恩施 445000；3.湖北恩施学院 医学院， 湖北 恩施 445000)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是各种外界因素导致的脊髓组织不同程度的急性损伤，可引起损伤平面以下的躯体感觉、运动功能障碍。自损伤开始，SCI经历原发性损伤、继发性损伤及损伤慢性期等阶段。继发性损伤可逆、可控，其病理过程影响着SCI的病程发展，其中细胞自噬(autophagy) 在该阶段的作用是目前较为热门的研究内容[1]。神经元是神经系统结构和功能的主要成分，死亡后无法再生，因此在继发性损伤期保护神经细胞、减少神经元凋亡是治疗的核心问题[2-4]。蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)为筒鞘蛇菰的提取物，研究表明，BPS具有良好清除自由基、抗氧化、抗凋亡等细胞保护作用[5]。已证实BPS具有拮抗D-半乳糖诱导的肝损伤作用[6-7]。目前尚无BPS在神经损伤中药效的研究和报道。本实验通过构建急性脊髓损伤模型大鼠，旨在探讨BPS对脊髓挫伤的治疗作用和机制，为药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

主要材料与试剂：苏木精、伊红染料盒尼氏染色液，BCA法蛋白浓度检测试剂盒、PBS缓冲液和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)、辣根过氧化物酶标记的抗兔和抗小鼠IgG 抗体(二抗)、β 肌动蛋白抗体(一抗)和LC3A/B 兔源单克隆抗体(一抗)(Santa Cruz公司)；SQSTM1/p62抗体(一抗)(Abcam公司)；BECN 1抗体(Cell Signaling Technology公司)；ECL化学发光显色试剂盒(Thermo公司)。

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量120～150 g，湖北省实验动物研究中心，许可证号:[SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

蛇菰多糖的提取与纯化：筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)经湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心鉴定。洗净烘干、捣碎成粗粉。75%乙醇浸泡蛇菰粗粉24 h后离心去溶剂，粉末再次干燥。再按蛇菰粗粉/去离子水为1/10的比例将蛇菰粗提取物反复浸泡、煮沸、离心并收集上清液，2～3遍。合并上清液行减压浓缩至1 L。所得浓缩液加入无水乙醇，低温静置过夜再次离心分离沉淀。沉淀以水溶解后再次离心除去不溶物，滤液减压浓缩后再加入无水乙醇洗涤3次，50 ℃烘干，得纯蛇菰多糖。苯酚-硫酸法测得多糖含量为61.3%。

大鼠的分组及处理：将大鼠分为假手术组(sham，n=10)、模型组(SCI，n=15，用改良Allen’s脊髓撞击法[8])、BPS干预组(BPS,n=45)。BPS组再分低、中、高3个剂量组，于术后2 h开始每天分别用25、50和100 mg/kg的BPS(n=15/组)灌胃14 d。

BBB评分评估运动功能：脊髓损伤后采用双盲法、隔日对各组大鼠进行Basso、Beattie，Bresnahan (BBB)运动测评，以评估后肢运动功能恢复情况。每天观察3次，每次时间为5 min，以3个记录数据的均值进行统计。根据BBB评分的多少可以将脊髓组织损害程度等级分为6个级别：A(0分)为完全性损害；B(1～7分)为重度损伤；C(8～14分)为中度损伤；D(15～18分)为轻度损伤；E(19～20分)为轻微损伤；F(21分)为正常[9]。

HE及尼氏染色法检测形态学：取大鼠损伤段脊髓(T9～T11)行HE及尼氏染色，观察脊髓损伤和神经元形态、数量，分布等情况。

Western blot 检测Beclin 1、LCS Ⅱ、p62、β-actin等蛋白表达：提取损伤段脊髓组织总蛋白。按既定程序行SDS-PAGE电泳、蛋白印记转PVDF膜、5%脱脂牛奶封闭、PBS洗膜后一抗(β-actin，1∶1 000；LC3A/B，1∶1 000；BECN 1，1∶800；SQSTM1/p62，1∶800)4 ℃孵育过夜。次日PBS洗膜3次，再加入HRP标记的二抗(IgG，1∶5 000) 37 ℃孵育4 h，再次PBS洗膜3次。最后采用化学发光法检测目标蛋白的表达。数据结果以目标蛋白/β-actin的吸光度值来分析蛋白的相对表达情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SCI大鼠运动功能的评估

sham组的BBB评分正常。SCI组评分-时间曲线明显低于sham组，第14日仍为重度损伤(P<0.05)。BPS组评分增长曲线呈剂量依赖性高于SCI组(图1)。

2.2 大鼠脊髓组织的形态变化

SCI组大鼠的脊髓背侧白质和中央灰质均有严重损伤：组织呈现海绵状，出现广泛水肿、细胞坏死，可见炎性细胞浸润，内见空洞形成。低剂量BPS组第14天的脊髓形态改善不明显，中、高剂量BPS组脊髓结构较清晰，细胞水肿及坏死减轻，空洞面积明显减少(图2)。

the relative change of BBB scores-time curve; *P< 0.05 compared with sham group on day 14; #P<0.05 compared with SCI group on day 14图1 脊髓损伤后各组大鼠BBB评分评估神经功能Fig 1 Neurological function evaluated by the BBBscores after spinal cord injury

与sham组相比，SCI组的神经元数量明显减少，胞体结构不完整，颜色浅淡，组织炎性反应较重。BPS组神经元数量比SCI组增多，胞体较大，结构相对完整，尤其是中、高剂量BPS组的神经元数量和胞体结构较SCI组有所改善。

A.hematoxylin-eosin staining on day 14(×40)；B.Nissl staining on day 14(×400); arrow showed positive cell图2 各组大鼠治疗第14天脊髓形态学改变Fig 2 Hemorphological changes of spinal cord on day 14 of each group

2.3 各组大鼠脊髓组织自噬标记蛋白的表达变化

与sham相比，SCI组LC3 Ⅱ表达上调，第7日表达最高(P<0.05)，而Beclin 1表达下降，于第7天表达最低(P<0.05)。另外，自噬降解底物p62在SCI发生后表达持续增加，于第7天表达最高(P<0.05)(图3A)。

与SCI相比，BPS组Beclin 1和LC3-Ⅱ在第7、14天均表达上调(P<0.05)，同时自噬降解底物p62的表达下降(P<0.05)。上述蛋白的相对变化水平随BPS剂量的增加而更加明显(图3B)。

A.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in sham and SCI groups; B.protein expression levels of Beclin1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 in SCI and BPS groups; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with SCI group

3 讨论

自噬是脊髓损伤后发生改变的细胞过程之一[10]。细胞内的异常蛋白、功能失调的细胞器可通过这一高度保守的溶酶体依赖性过程进行清除。自噬是一个复杂动态过程，从自噬信号启动、形成自噬小体、自噬体与溶酶体融合至分子降解以及再利用称为自噬能通量[11]。通量的破坏会导致受损细胞内损伤细胞器和异常蛋白的蓄积,从而干扰细胞的功能，并可能导致细胞的死亡[11-12]。作为终末分化性细胞，神经元、少突胶质细胞等细胞的自噬对自身质量控制十分重要[13]。在SCI患者中，挫伤性损伤患病率极高。本研究以大鼠脊髓挫伤为疾病模型，对SCI进程中的自噬过程进行初步探索，发现在亚急性期(损伤7 d)自噬体的形成(LC3 Ⅱ/Ⅰ)逐渐增加，但负性蛋白p62并没有下降，而是升高。同时在此阶段出现自噬启动不足,提示自噬能通量在SCI进程中存在异常。这与既往的研究结果[14-15]一致。目前尚不清楚这一异常自噬活动的机制。

大量研究报道了BPS在肝损伤、疲劳等方面的拮抗作用，但是否具有神经保护作用尚不清楚，本研究证实了3种剂量的BPS均具有抗脊髓损伤、促进功能恢复的作用，尤其是在亚急性BPS功能改善作用更明显。 尽管细胞自噬在SCI继发性损伤阶段是一个非常重要的病理过程，但当存在自噬能通量异常时，会加重神经细胞的功能障碍，甚至最终导致细胞死亡[14]。BPS可以增强损伤组织中的自噬启动，降低负性蛋白的表达，表明BPS可以通过调节自噬能通量这一途径拮抗脊髓损伤。

综上所述，本研究证实了筒鞘蛇菰活性提取物BPS可以改善大鼠脊髓损伤后的运动功能障碍，通过增强损伤组织中的自噬启动，降低负性蛋白的表达，调节自噬能通量异常等途径来保护神经，拮抗损伤。本研究为临床应用保护神经功能的用药及BPS药物的开发提供一定的依据。