三种镰刀菌引起的板栗内腐病病原菌鉴定

张娜娜， 温晓蕾， 李双民， 冯丽娜， 霍佳欢， 兰淑慧，栗佳宁， 郭思柔， 王建华， 齐慧霞*

（1.河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛 066600；2.河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071002；3.河北省昌黎县职业技术教育中心，河北 秦皇岛 066600）

板栗属壳斗科，在6 000多年前就已经存在相关记录，被人们称作“千果之王”“铁杆庄稼”。板栗营养丰富，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素等，具有保健功能，能够起到养胃、强筋、消肿等功效，因此深受人们喜爱[1]。

板栗内腐病又称栗干腐病、栗黑斑病，有黑斑、褐斑、软腐3 种类型，主要危害果仁，病斑颜色多为黑色、褐色。发病初期形成浅褐色病斑，严重时腐烂并有酸味；后期病斑处出现空洞，果仁硬化，湿度大时产生菌丝体，同时病斑处易被细菌侵染形成软腐[2]。板栗内腐病是在贮藏和运输过程中的常见病害，严重地影响了板栗品质，给果农带来巨大的经济损失。板栗内腐病主要是由致病微生物侵染从而导致栗仁腐烂[2]，李德茂等[3]对迁西板栗贮藏过程中的致腐微生物进行分离鉴定，共分离出12个属的真菌，包括毛霉属、青霉属、镰刀菌属、曲霉属、疫霉属和短梗霉属等，但未对致病菌进行深入研究。本研究室于2020年9—10月对从河北省唐山市迁西县和遵化市采集的板栗进行调查时发现1 种病害，该病害主要危害栗仁，症状表现为在栗仁的表面产生黑褐色或深褐色病斑，随着病斑的蔓延，病斑坏死。因此，本研究通过病原菌分离培养、致病性鉴定、形态学和分子生物学鉴定，明确该病原菌的种类，以期为该病害的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

板栗病果于2020年9—10月采集自河北省唐山市迁西县栗园，品种为早丰。

PDA 培养基：水1 000 mL，琼脂粉 20 g，葡萄糖20 g，马铃薯200 g。

仪器：PCR 仪(S1000, Bio-rad)、电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)、恒温培养箱（ZGZ-450，上海丙林电子科技有限公司）、电热鼓风干燥箱（GZX-9140MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、Si显微镜（尼康，日本）。

1.2 病原菌的分离与纯化

采用组织分离法[4]分离和纯化病原菌，从栗果的病健交界处切取5 mm×5 mm 的组织块，将组织块用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3 次，用灭菌滤纸吸干表面水分，接种至PDA 培养基上，每皿3块，倒置于25 ℃的恒温箱中培养5 d，待菌落长出后，挑取菌落边缘处，接种到新的PDA培养基中培养纯化，纯化后转入斜面试管4 ℃条件下保存备用。共分离纯化出3 株菌株，分别编号为BL-5、BL-7和BL-9。

1.3 病原菌的形态学鉴定

将供试菌株接种到PDA 培养基，于25 ℃恒温条件下培养7 d左右，观察病原菌在培养基上的菌落形态，从菌落表面挑取培养物，显微镜下观察菌丝形态及孢子情况，进行形态学鉴定[4-6]，初步确定病原菌分类地位。

1.4 致病性鉴定

根据柯赫氏法则[4]，采用离体接种法检测病原菌的致病性。选取健康板栗栗果，用75%乙醇表面消毒，无菌水冲洗2 遍，用针刺法在果仁接种部位制造伤口，取7 mm活化后的菌丝块接种于果仁的伤口部位，保鲜膜固定，以无菌水作为对照，置于培养皿（直径150 mm）中25 ℃条件下保湿培养，24 h 后去掉菌饼，记录发病情况，对发病栗果的病原菌进行再次分离鉴定，与原接种菌进行比较。

1.5 病原菌的分子鉴定

从培养5 d 的菌株上挑取适量菌丝，放入1.5 mL的灭菌离心管里，用研磨机将其磨碎，按照DNA 基因组试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）说明书提取DNA。对病原菌ITS 序列进行扩增，真菌生物核糖体DNA 引物ITS1 和ITS4 序列分别为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[7]。PCR 反应总体积 25 μL：引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 12.5 μL，2×EsTaqMasterMix 8.5 μL。ITS 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延 伸 1 min，32个 循 环 ；72 ℃ 延 伸10 min；4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，产物样品合格后送往生工（上海）公司测序。将测序所得菌株DNA-ITS 序列与NCBI 中进行同源性比对，用MEGA-X 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的菌落及形态特征

BL-5 菌株在PDA 培养基上初期菌丝呈白色，菌落中心部位有淡红色素；后期菌落逐渐变成深红色，附着白色菌丝，且菌落中心可见黄色菌丝（图1），菌丝中心生长密集，边缘稀疏。菌丝生长速度较快，4～5 d就可长满90 mm 培养皿。经形态学鉴定，初步将BL-5 鉴定为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）。

图1 BL-5的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of the BL-5

BL-7 菌株在PDA 培养基上培养6 d 的菌落呈现白色、绒毛状，圆形或近圆形，菌丝边缘较稀薄，能产生大量的小型分生孢子，孢子呈长椭圆形或梨形，颜色透明，具有隔膜，表面光滑，分生孢子梗具分枝（图 2），分生孢子大小为 26.356 μm×182.659 μm～37.728 μm×145.745 μm。经形态学鉴定，初步将BL-7 鉴定为层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）。

图2 BL-7的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of the BL-7

BL-9 菌株在PDA 培养基上菌落呈圆形，边缘光滑，菌丝呈棉絮状。初期菌落边缘呈白色，中心呈粉红色；随着菌落的生长，后期菌落颜色逐渐变为边缘呈浅粉红色，中心呈浅黄色或褐色；从正面观察，菌落上附有白色绒毛状菌丝。能够产生大型的分生孢子，小型分生孢子较少，有隔膜，孢子的两头较细长、中间部位粗，似镰刀，弯曲或直立，具有厚垣孢子（图3），孢子大小为18.386 μm×359.836 μm～19.385 μm×364.643 μm。经形态学鉴定，初步将BL-9 鉴定为木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）。

图3 BL-9的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of the BL-9

2.2 致病性鉴定

图4显示，健康板栗接种BL-5菌株后3 d开始发病，初期病斑呈深褐色，外缘处有淡黄色晕圈；后期病斑颜色逐渐加深，呈黑色，外缘仍有黄色晕圈，湿度大时会出现白色或浅红色菌丝体，有异味并分泌粘状物。根据柯赫氏法则，再次从该发病部位分离病原菌，能够得到与BL-5 形态特征相同的病原真菌，因此，证实菌株BL-5为致病菌。

图4 致病性测定Fig.4 Pathogenicity detection

健康板栗接种BL-7 菌株后2 d 开始发病，潜育期较短，初期病斑呈深褐色，在中心处可见深黄色病斑，分布不均匀；随着湿度的增大，病斑处生长白色菌丝。根据柯赫氏法则，再次从该发病部位分离病原菌，能够得到与BL-7 形态特征相同的病原真菌，因此，证实菌株BL-7为致病菌。

健康板栗接种BL-9 菌株后3 d 开始发病，初期为浅褐色圆形小病斑，颜色分布均匀，后期病斑边缘处有深褐色晕圈，中心呈淡黄色或浅褐色，病健交界处明显。根据柯赫氏法则，再次从该发病部位分离病原菌，能够得到与BL-9 形态特征相同的病原真菌，因此，证实菌株BL-9为致病菌。

2.3 分子鉴定

以菌株 BL-5、BL-7、BL-9 的基因组 DNA 为模板，以ITS引物进行PCR 扩增，BL-5、BL-7、BL-9分别获得553、564 和552 bp 条带；扩增产物测序后与BLAST 进行比对，并建立分子系统发育树，结果（图 5、6 和 7）表 明 ，BL-5 与 禾 谷 镰刀 菌（Fusarium graminearum）KJ847741、BL-7与层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）MW686898、BL-9 与木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）KU984711 的同源性都达到了99 %，因此，BL-5、BL-7、BL-9 分别鉴定为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、层出镰孢 菌（Fusarium proliferatum）、木 贼 镰 刀 菌（Fusarium equiseti）。

图5 BL-5的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of BL-5

图6 BL-7的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of BL-7

图7 BL-9的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of BL-9

3 讨论

国内外学者对板栗内腐病病原菌进行了深入的研究，刘建华等[8]发现，镰刀菌引发的板栗栗果内腐病的症斑为黑褐色，与本研究中镰刀菌引起病症结果一致；戴雨生等[9]对板栗病果进行分离鉴定发现，炭疽菌、小穴壳菌分别占分离菌数量的36.1%、31.1%，为优势菌；王海霞等[10]从板栗栗仁病部分离出青霉属、链铬孢属、丝核菌属等共11个属，其中，聚端孢属、链格孢属、镰刀菌属、壳梭孢为优势菌；梁丽松等[11]研究发现，镰刀菌属、链铬孢属等在板栗病发部的丰度较高；贺伟等[12]研究发现，Penicilliumspp 丰度较高；Tziros 等[13]研究表明，Sclerotinia pseudotuberosa引起板栗内腐病。综上所述，不同地区间引起板栗腐烂的病原菌存在差异，这可能和地理、环境、气候等条件有关。近年来，板栗内腐病的发生逐年加重，严重影响了板栗的产量和品质。本研究证实，禾谷镰刀菌、层出镰孢菌、木贼镰刀菌为引起板栗内腐病的致病菌，下一步应对镰刀菌的生物学特性、流行与传播、药剂防治等进行深入研究，为板栗内腐病的防治提供理论指导。