多种外源激素联合诱导德国牧羊犬同期发情的效果研究

修福晓,王国华,李炳志

(1.中国刑事警察学院 警犬技术学院，辽宁 沈阳110034；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.河北北方学院 动物科技学院，河北 张家口075131)

随着中国经济发展和社会不断进步，宠物犬和工作犬作为人类忠实的伴侣，对其数量、质量的要求也越来越高。由于犬存在特殊的生殖生理特性和繁殖规律，并且犬的人工授精技术还未成熟，若错过发情期或发情期未受孕，产仔数就会大大减少。目前，应用外源激素诱导同期发情的技术在猪、牛等家畜上研究较多，并且取得了良好的效果。国内外对犬同情发情研究也有相关报道。张跃骏等采用孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)两种激素联合使用，诱导母犬同期发情和排卵，取得良好的同期发情率(100%)和排卵率(55%～75%)，说明使用PMSG和HCG等外源激素可以对乏情期的母犬达到有效的诱导同期发情和排卵作用。赵兴旺联合使用5种外源激素对4只母犬进行同期发情和超数排卵试验，结果表明，4只试验犬在使用药物后18 d左右进入发情排卵期。Concannon等研究促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)不同使用剂量和使用时间对比格犬同情发情的影响，连续注射3～5 d后同期发情率较高。Michelle对以往使用不同激素诱导犬同期发情研究结果进行回顾总结，发现外源性促性腺激素(促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、HCG、PMSG)相比其他激素可以较好地诱导犬同期发情。目前研究大都集中在外源激素对母犬发情率以及同期发情的效果上，对同期发情后的怀孕率和产仔数的研究较少。本试验应用不同外源性激素组合来优化同期发情的方案，对发情后的母犬进行配种，进一步观察其怀孕率和产仔数，旨在建立一种能够提高犬诱同期发情率、怀孕率以及产仔数的技术方案，提高犬的繁殖率，同时方便人们对犬进行统一配种、繁殖、抚育和管理等。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取沈阳某警犬基地3～4岁健康德国牧羊犬母犬36只，体重为 27.56±3.41 kg，所有试验犬发情正常且自然交配后能够分娩产仔。经常规体检与编号后，分别饲养于阳光充足且有足够运动空间的犬舍中，统一饲喂商品化犬粮。

1.2 试剂及设备

用于阴道上皮细胞涂片和染色的试剂、器械：0.9%灭菌生理盐水、甲醇溶液、瑞吉氏染色液、无菌棉签、载玻片、显微镜。

用于同期发情的激素和卵巢监测设备：前列腺素(PG，0.5 mg/支)、孕马血清促性腺激素(PMSG 1 000 IU/支)、人绒毛膜促性腺激素(HCG 1 000 IU/支)、PG600(PMSG 400 IU+HCG 200 IU/支)、FG600(FSH 400 IU+HCG 200 IU/支)均来自于广州威生医药科技有限公司；彩色多普勒超声仪(型号为MyLab50，意大利百胜集团)。

1.3 外源激素使用的时间

试验中所选取的犬只使用外源激素的时间为距离上次发情5～6个月。

1.4 试验方案

将选取的3～4岁健康德国牧羊犬母犬36只，随机分为A、B、C 3个试验组和对照组D组。每组9只，每组设3个重复，每个重复3只。A、B、C、D组分别采用不同激素(PG/PMSG/HCG、PG/PG600/HCG、PG/FG600/HCG、空白)组合进行同期发情处理，外源激素处理方案见表1。

表1 外源激素处理方案

1.5 检测内容及项目

1.5.1 各组同期发情率、受胎率、产仔数的测定 同期发情率以经激素处理后发情时间不超过5 d视为同期发情；各组受胎率=(配种后经超声检查怀孕犬数÷各组总犬数)×100%；产仔数为母犬配种后分娩的仔犬数。

1.5.2 多普勒超声仪对卵泡的监测 使用彩色多普勒超声仪监测各组卵泡最大直径、卵泡透亮度和卵泡数量。每天监测1次，结果取平均值。同期发情的判定，以各犬间开始发情时间不超过5 d视为同期发情。对于外源激素处理组和空白对照组,在发情后用公犬自然交配，通过最终是否产仔犬来确定受胎率。

1.5.3 阴道角化上皮细胞的检测 每组随机选择具有发情症状的5只犬，对其发情前2 d、发情当天(记为0)、发情后的第2、4、6、8、10、12、14天的阴道进行采样、涂片,用瑞吉氏染色液进行染色、镜检。

1.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 同期发情率的检测

A、B、C、D组同期发情率检测结果见表2。结果显示：B组同期发情率最高，与A、C、D组差异显著(<0.05)，其次为A组，C组最低。

表2 各组同期发情率检测结果

2.2 彩色多普勒超声仪对卵巢发育的监测

超声仪监测结果表明：4组卵泡平均最大直径差异不显著(>0.05)，但A、B、C组卵泡数量较对照组多，且平均排卵时间较对照组缩短(表3)。对卵巢和卵泡发育及形态进行超声监测结果显示(图1)：A组，HCG注射后第4天观察到3个卵泡，其中远离探头的卵泡透亮，接近探头的2个卵泡不透亮；B组，HCG注射后第4天观察到的卵泡最大直径为2.69 cm，卵泡透亮，卵泡界限明显；C组，HCG注射后第4天观察到一侧卵巢内有3个卵泡，卵泡均比较透亮，卵泡最大直径0.9 cm。D组发情后第3天的卵泡最大直径为1.06 cm，但是与A、B、C相比卵巢内界限模糊，卵泡不明显。

表3 各组卵泡发育超声监测

图1 卵巢和卵泡发育的超声监测

2.3 阴道上皮细胞完全角化时间检查结果

随机选取A、B、C、D组中具有发情症状的5只犬，将涂片检查阴道上皮细胞完全角化(图2)的犬编号记录在相应天数内。结果表明，A、B、C组阴道上皮细胞完全角化时间比D组提前，主要集中在发情后的6～8 d，而D组阴道上皮细胞完全角化时间集中在发情后的10～14 d。具体见图3。

图2 阴道涂片角化上皮细胞检查(100×)

图3 阴道上皮细胞完全角化时间

2.4 受胎率和产仔数

对A、B、C、D组受胎率和产仔数的统计结果见表4。结果显示：C组受胎率最高，与A、B、D组差异显著(<0.05)。A、B、C组的平均产仔数均高于对照组，差异显著(<0.05)，A组产仔数最高，与B组产仔数相比差异不显著(>0.05),与C、D组产仔数相比差异显著(<0.05)。

表4 各组受胎率和产仔数

3 讨 论

3.1 多种外源激素联合使用能够诱导德国牧羊犬同期发情

国内外学者在开展诱导犬同期发情激素的选择上，有使用单一激素诱导，如Dernsis等将3只处于乏情期的比格犬用PMSG按500 IU/d的注射剂量进行处理，直到出现发情症状，使用外源激素处理时间最长为10 d左右。也有采用2种外源激素诱导犬同期发情，如张跃骏等采用1次注射PMSG 500 IU/只、24 h/次，连用5 d，第10天1次注射HCG 500 IU/只和1次注射PMSG 500 IU/只、24 h/次，连用7 d，第10天1次注射HCG 500 IU/只2个处理方案，结果表明2个外源激素处理方案均能很好地诱导犬同情发情及排卵，同期发情率达100%，排卵率分别为55%和75%。张玉西等研究表明，PMSG、PG、HCG联合使用时具有较好的催情作用，用PMSG+PG和PMSG+HCG处理的发情率最高，达62.96%和61.54%，催情效果优于PMSG单独使用。本研究依据不同外源激素的作用机理，如PG具有较好的溶解黄体作用、促使卵巢上的卵泡发育而发情，PMSG具有催情和排卵的作用，HCG具有使卵泡成熟和排卵的作用等，采用不同激素联合使用后，A、B、C组出现发情的平均天数为4～7 d，而对照组出现发情的平均天数为11 d，且并未出现同期发情。说明多种外源激素联合使用可以诱导德国牧羊犬同期发情，并可以缩短母犬的发情时间。其中B组同期发情率最高，同期发情率为90%；这可能是该组药物中PG600所含的PMSG能够促进卵泡成熟，HCG能够促进排卵的原因。本试验结果对犬同期发情的效果要优于张玉西的报道，与张跃骏报道相一致。

3.2 外源激素联合使用未对德国牧羊犬卵泡发育产生影响

Renton研究表明，通过超声仪连续监测，发现与激素水平变化不相符的卵泡发育情况：使用外源激素后，导致了部分试验犬卵泡发育过大。因此通过超声仪监测卵泡发育，发现药物是否对卵巢产生影响，尤其是对卵巢过度刺激征象情况进行监测，有利于对临床用药剂量合理调整进行指导。本试验中，通过超声对卵泡监测发现，使用外源激素后，仅加快了卵泡成熟和排卵时间，并未对卵泡的发育形态产生影响(各激素组卵泡最大直径与对照组之间差异不显著)。这是否与试验中各试验组所选取试验犬数量有限，以及试验犬为3～4岁的青年犬等因素带来的试验差异有关，还有待进一步的验证。

3.3 对阴道上皮细胞的监测可以预判外源激素诱导犬同期发情时间

Hatoya等对阴道上皮细胞的变化与发情周期之间的关系研究发现，当阴道上皮细胞完全角化时，犬处于发情期，可对犬进行配种。但是在使用药物后，对发情周期产生影响的犬，其阴道上皮细胞的变化情况，还未见报道。本试验通过对犬阴道上皮的涂片监测，发现使用外源激素后，可以使阴道上皮细胞完全角化时间提前到6～8 d，结合超声仪对卵泡的发育监测，使用外源激素后，阴道上皮细胞完全角化的时间与卵泡成熟的时间基本一致。因此，使用外源激素后，也同样可以通过对阴道上皮细胞的变化，来预判犬的发情周期。

3.4 外源激素联合使用可有效提高德国牧羊犬的受胎率和产仔数

丰培金等认为联合使用PMSG和HCG，可诱导母犬同期发情，但人工授精后受胎率较低，主要原因在于P4降低导致黄体功能不足。结合以往的研究结果，本试验在选择外源激素对各试验组的处理上，增加使用PG，以提高黄体功能。试验结果表明，使用PG联合其它外源激素处理后的各试验组，受孕率与自然交配的受孕率基本一致，并未降低。试验C组受胎率最高，是否与FSH有关，有待进一步验证。本试验中的外源激素方案A组合(PG/PMSG/HCG)使德国牧羊犬的产仔数最高，该结果与张玉西的报道相一致。由于不同犬种、不同体型的犬在发情周期、平均产仔数方面存在部分差异。本试验结果是否对其他犬种适用，还需要更多的相关数据来验证。

4 结 论

本试验通过对德国牧羊母犬采用外源激素组合进行处理后，发现阴道上皮细胞完全角化的时间与卵泡成熟的时间基本一致；外源激素A组合(PG/PMSG/HCG)诱导德国牧羊犬同期发情并自然交配后产仔数最高，对于犬的高效繁殖具有重要的临床意义，可以在德国牧羊犬的繁殖中进行推广应用。