乳酸菌高密度培养技术的研究进展

左梦楠，刘 伟 ，全 琦，张菊华,

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410000；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南长沙 410000；3.果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南长沙 410000；4.湖南省果蔬加工与质量安全国际科技创新合作基地，湖南长沙 410000）

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌可分为乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和片球菌属5 个属。乳酸菌发酵不仅能提高食品的营养价值，改善食品风味，还能提高食品的保藏性和附加值。乳酸菌发酵剂广泛用于食品深加工，生产酸奶、肉类、面包、泡菜等。绝大部分乳酸菌都是人体内必不可少的、可为宿主带来健康益处、具有重要生理功能的益生菌群，如调节肠道菌群平衡、改善营养物质的消化、加强新陈代谢，增强免疫作用并表现出抗癌和抗病毒等作用。近年来，由于人们越来越重视乳酸菌的功能特性及其对人体健康的有益作用，乳酸菌在医药、食品、生物技术等领域均得到了广泛的应用。

高活性直投式乳酸菌发酵剂具有发酵活力强、体积小、便携、使用方便等特点，可直接用于发酵制品的生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种退化和污染。乳酸菌高密度培养是高活性发酵剂制备的关键环节，其显著性特点是能够以较低的发酵体积和较短的发酵周期，获得较高的目标菌体密度，在发酵设备和体积不变的情况下，高密度发酵可以提高批次发酵结束时的产品得出量。本文从影响乳酸菌高密度培养的营养物质、培养条件和培养方法等重要因素进行了归纳总结，以期为乳酸菌的高密度培养和直投式发酵剂的制备提供理论依据。

1 乳酸菌高密度培养的营养消耗模式

乳酸菌对生长条件要求挑剔，同种物质对不同乳酸菌的增殖效果不一样。影响乳酸菌高密度培养的营养物质需求可分为碳源、氮源、无机盐、生长因子等。对乳酸菌营养成分的消耗模式进行分析，可为乳酸菌的高密度培养提供理论依据。

1.1 碳源

碳源作为微生物生长过程中的重要营养物质，为乳酸菌的生长提供能量，提高物质向细胞的运输速度，加快细胞合成和新陈代谢，促进乳酸菌的快速增殖。乳酸菌生长所需要的碳源一般是糖类及其复合物，葡萄糖是最常见的碳源类物质，乳酸菌主要通过糖酵解途径、Leloir 途径、磷酸戊糖途径及磷酸乙酮醇酶途径等对糖类进行分解代谢，不同糖类对乳酸菌的代谢途径影响不一，不论以何种糖类物质为碳源，一般都通过转化为葡萄糖或葡萄糖6-P 进行反应，碳水化合物代谢和糖酵解变化过程如图1 所示。

图1 碳水化合物代谢和糖酵解变化示意图[16]Fig.1 Schematic diagram of changes in carbohydrate metabolism and glycolysis[16]

不同乳酸菌的糖类促生长作用也不一样。在增殖过程中，提高脱脂乳培养基中的乳糖浓度可以显著提高的细胞密度。单糖和双糖对BBE 09-18 的促生长效果优于淀粉等多糖，所研究的碳源中使用麦芽糖培养的效果最好，活菌数可达1.88×10CFU/mL，其次是-乳糖，活菌数可达1.83×10CFU/mL。乳酸杆菌属对单糖和双糖的代谢亲和能力具有相似性，可将单糖和双糖同发酵转化为乳酸。混合糖培养物可作为乳酸菌增殖的优良底物，研究在2 g/L 的半乳糖和10 g/L 的阿拉伯糖混合物中生长具有最大的活性。益生元也具有作为碳源底物的潜力，在食品工业上低聚果糖可促进乳酸菌和双歧杆菌的生长。与商业Raftilose（R）P95 相比，乳酸菌在果寡糖（FOS）混合物中的细胞密度更高,有些菌株在产生的FOS 混合物中生长的速度甚至比在所有其他碳源中都要快。乳果糖衍生寡糖也可作为乳杆菌属、链球菌属和双歧杆菌属促生长的碳源类物质，其促增殖效果还与糖苷键结构、乳酸菌酶活性有关。任何食品工业的成功通常都集中在碳底物的成本上，碳源的优化是降低经济成本的关键。

1.2 氮源

乳酸菌不能合成一些生长必须的氨基酸等物质，从而严格限制了乳酸菌的高密度生长。尤其营养缺陷型的乳酸菌菌株，只有在具有可用氮源的适宜环境中才能高效生长和增殖。实验室高密度培养过程中一般添加游离氨基酸，或者已降解的蛋白质或肽类作为生长过程的氮源，进行能量代谢、ATP 转运等，乳酸菌利用氨基酸和蛋白质的机理如图2。如在培养基中添加大豆蛋白和乳清蛋白水解物可促进乳酸菌的生长，多肽和寡肽也可作为植物乳杆菌的有效氮源。大量研究表明促进乳酸菌生长效果最显著的氮源类物质为酵母膏，相比其它的氮源，它所达到的细胞密度最高，虽然单独添加的氮源类水解物增殖效果不如酵母膏表现突出，然而与酵母膏联合使用可使细胞数量提升1.0～1.5 个数量级。所以进行乳酸菌高密度培养培养成分优化，一般会采用复合氮源的方法进行优化研究。

图2 乳酸菌利用氨基酸和蛋白质的机理图[18]Fig.2 Diagram of the mechanism of lactic acid bacteria using amino acids and protein[18]

氮源类物质是乳酸菌生长过程中的关键成分，实验室常用的氮源类物质生长效果良好，但工业化应用的成本往往十分昂贵。寻找经济高效的氮源类替代物是工业化应用面临的难题。目前常采用其它较为经济的氮源与培养过程中的昂贵氮源混合优化，通过减少酵母膏等昂贵类氮源的使用来降低成本。Hom 等发现鳕鱼内脏水解物（蛋白胨）是一种很有前途的氮源类经济生长介质，其与酵母提取物以1:1 的比例混合替代可提高植物乳杆菌10%的生物量，降低工业生产成本。玉米浆含有高含量的氨基酸和多肽以及大量的复合维生素，是一种极好的低成本氮源，可显著增强乳酸杆菌的生长。

1.3 无机盐

乳酸菌高密度培养过程补充无机盐主要是作为缓冲物质，调节菌体生长过程中的pH 变化，维持乳酸菌生长的适宜pH 环境，延长发酵剂的活性。乳酸菌培养基中常用的缓冲盐体系有磷酸氢二钾/磷酸二氢钾、磷酸氢二钠/柠檬酸、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、磷酸氢二钠/磷酸二氢钾、磷酸二氢钾/氢氧化钠、磷酸氢二钾/乙酸钠/柠檬酸钠等。缓冲盐中的无机离子还能以阳离子、阴离子的形式被乳酸菌吸收进行生物合成、酶活性激活和运输转运、也在一定程度上为乳酸菌的生长补充了微量元素。比如Cl、NO、SO、PO、Na、K、NH、Ca、Mg等是生物体大量所需的，而其它如Mn、Zn只需少量或微量。

无机盐中某些离子的类型和浓度对乳酸菌的生长和活性影响也不相同。细胞能量酶的转运结合可能需要依赖某些多价阳离子如Mg、Ca和Mn等，Mg、Mn可显著促进格氏乳杆菌的最大比生长率，而Zn、Cu对其生长具有抑制作用。当盐浓度超过0.04 mmol/L 时，IMAU95219的菌体密度随缓冲盐体系的浓度增加而降低。Dupree 等通过研究发现合适的盐浓度不仅不会抑制乳酸菌等有益微生物的生长，反而还会刺激它们的生长。植物乳杆菌经乳酸和乳酸钠盐溶液亚致死水平诱导处理后，与细胞膜转运、氨基酸代谢、核苷酸代谢和细胞生长相关的基因表达显著上调，其活菌存活率显著提高。无机盐还可作为菌体细胞成分的构成、酶的激活剂或抑制剂。研究还表明免疫生物菌株在缓冲盐中显示出很高的内在耐热性，增强了菌株在应激条件下的保护能力。

缓冲盐对乳酸菌的生长具有重要作用，不同微生物生长所需无机盐的种类也是不一样的。乳酸片球菌受磷酸氢二钾的作用生长效果显著增强，IMAU95219 的最适生长缓冲盐体系为磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸钠，格氏乳杆菌的最适缓冲盐体系组成为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。

1.4 生长因子

生长因子是一类能够调节微生物生长，但乳酸菌自身难以合成的一类结构和性质不同的物质。常用作生长因子的物质有三种，分别是氨基酸、核苷酸和维生素类物质（见图3）。其中对乳酸菌生长效果影响较显著的当属氨基酸类和维生素类物质。乳酸菌中的氨基酸分解代谢在氧化还原力或代谢能量的产生、细胞内pH 的控制以及抗应激方面发挥着重要作用。研究表明精氨酸可以促进嗜热链球菌T1C2的生长，在KLDS 1.0738的高细胞密度生长过程中，氨基酸消费量最高的是谷氨酸（1.62 mmol/L）和甘氨酸（1.53 mmol/L），其次是天冬氨酸（1.15 mmol/L）和丙氨酸（0.85 mmol/L），它们参与保护KLDS 1.0738免受低pH 环境的损害。Yao 等在以脱脂乳为乳酸菌培养基质的高密度培养过程中，发现V、V和生物素在希腊乳杆菌生长过程中具有不可或缺的作用，这可能是因为维生素与脂肪酸的合成、糖代谢主要酶的表达有关。许多乳酸菌是嘌呤和嘧啶类营养缺陷菌，这些乳酸菌可能对脱氧核苷有额外的需求，乳球菌随嘌呤含量的增加，可增强对多种胁迫的抗性，提高生长能力。随着研究的不断深入，发现果蔬汁可作为益生菌增殖的良好载体物质，在微生物发酵过程中，将其作为外源增殖因子加入到乳酸菌培养基中确实会提高乳酸菌的生长能力和活性。这可能是因为果蔬汁的成分较复杂，含有纤维、矿物质和维生素等，比单一的化学合成成分营养元素的种类更加多元，符合乳酸菌的生长要求，例如番茄汁、胡萝卜汁等作为外源因子可明显促进菌株的增殖。

图3 乳酸菌培养的促生长因子Fig.3 Growth-promoting factors of lactic acid bacteria culture

1.5 其它营养成分

吐温类物质常被用作乳酸菌生长培养基的添加剂，其所含的油酸部分可以影响细胞膜的组成和特性，从而可以促进乳酸菌的生长，保护细胞免受酸性、营养消耗等不利环境的影响。研究发现不饱和脂肪酸是大多数乳酸菌生长的必需因子，可代替吐温类物质促进乳酸菌的生长，其主要是在细胞质膜上发挥作用，通过显著降低脂肪酸生物合成所需的能量来刺激生长，研究表明脂肪酸可以增加低温下干酪乳杆菌在干酪提取物中的细胞密度。

2 乳酸菌高密度培养基选择

2.1 基础培养基

对高密度培养来说，基础培养基的选择至关重要，它必须适合乳酸菌的生长，并且能够得到大量高活力的菌体。乳酸菌对生长条件的要求很挑剔，不同种类的乳酸菌生长需求不同，所需要的营养成分及比例也不尽相同，而且乳酸菌在不同生长时期的物质消耗也不相同，这就决定了乳酸菌在培养过程中的复杂性。如表1 所示，列举了关于不同种类的乳酸菌培养基，一般以化学合成成分的培养基为主，依据MRS培养基为基础培养基，对其所含碳源、氮源、无机盐等进行种类和比例优化，同时获得较高的细胞密度，大多在10～10CFU/mL。例如以蔗糖、海藻糖、乳糖等糖类物质代替培养基中的葡萄糖，以成本较低的大豆蛋白粉代替昂贵的氮源类物质，减少培养基的生产成本。

表1 常见乳酸菌的高密度培养基Table 1 High-density medium for common lactic acid bacteria

2.2 改良副产物培养基

商业微生物培养基因为其使用的成分往往很昂贵，因此在乳酸菌高密度培养生产中的应用成本是十分巨大的。由于乳酸菌通常用于各种行业，特别是作为益生菌，寻求更便宜的替代介质是很有必要的。大量研究表明果蔬加工副产物可在乳酸菌培养过程中起到补充碳源、氮源等营养物质的作用，能够显著支持乳酸菌的生长。随着乳酸菌市场的应用日益增大，选择经济高效的新型发酵培养基成为未来不断追求的目标。利用食品废弃物或工、农业副产品等作为乳酸菌高密度生产的培养介质，是一种很有前途、对环境友好的乳酸菌高密度培养方法。

2.2.1 农业副产物 利用低成本的营养物质将大规模降低生产成本。常见的农用副产物有乳清、乳清渗透物、淀粉类废弃物、玉米浆木质纤维素材料等。Katarzyna 等以小麦、玉米、大麦和黑麦粉为主要成分，设计了一种半固态发酵培养基，结果表明所选菌株的细胞产量比在MRS 培养基中高。张艳丽研究了五种农副产品棉粕、豆粕、麸皮、次粉、葵花盘粉作为营养因子对植物乳杆菌生长情况的影响，结果表明棉粕和豆粕可显著促进植物乳杆菌生长，使用淀粉类农作物废弃物也是一种良好的降低益生菌生长所必需的碳源营养成本的解决方案，例如玉米面可作为益生菌LOCK 0860 生长培养基的基本介质，而且在后续喷雾干燥过程中与菊粉混合作用可使细胞活力提升4 倍以上，具有很大的经济效益。Thakur 等在模拟GIT 条件下，用竹笋和马铃薯皮提取物作为发酵底物，探究乳酸菌的体外益生作用，结果表明不仅降低了碳底物的成本，而且通过将环境废弃物转化为合适的生物质，减少了预期发酵目标的成本。

2.2.2 工业副产物 食品工业副产物如大豆渣、糖蜜、工业废水、果汁废弃物等含有基本的营养物质，可作为乳酸菌增殖的培养介质，这些废弃物的处理涉及重大的经济和环境管理成本，减少环境中污染物的必要性和最大限度地提高原材料回报的必要性鼓励了人们寻求利用食品工业废料作为培养基基础的新方法。Coghetto 等首次报道了利用大豆液体酸性蛋白渣进行植物乳杆菌生长的研究，这种残渣含有糖和低分子量的蛋白质，常作为工业废水排放，将它作为一种替代基质生产益生菌，而不需要动物来源的成分，可获得高生物量的批量生物反应器。酒厂乙醇生产废水与糖蜜两者副产物结合可作为一种低成本的培养基，且其产量和生物量密度与传统工业培养基相当，这也是首次尝试寻找用于生产植物乳杆菌生物质的低成本培养基的方法。在对生物质工业副产物的研究过程中，发现糖蜜是一种很好的培养材料，Papizadeh 等利用工业副产物甘蔗糖蜜研制了一种高产RPR 42 的培养基。果汁等产品生产过程中的果渣也富含多种营养成分，其处理问题一直是产业发展的瓶颈，利用苹果渣制备生物菌剂可进行乳酸发酵综合利用。利用枣汁废料优化设计的新型培养基可对乳酸乳球菌的生长具有显著的促进作用。海藻生产生物柴油后的废弃物也可作为发酵底物进行乳杆菌增殖。

2.2.3 其它副产物 除农业、工业副产物外，研究发现水生杂草水莴苣的汁液可以直接用于制备生长培养基，通过分析表明，它含有丰富的发酵糖、蛋白质和氨基酸，以水莴苣汁为原料制成的培养基，细胞密度比普通培养基高出10%～60%，且对水解物的产糖没有任何副作用。加工处理副产物的优化除了用作乳酸菌生长的培养基外，还可以作为固定化基质的形式存在，提高酶催化活性，避免引起竞争抑制问题。总而言之，对副产物的利用发展有助于最大程度实现生物质能的利用，随着时代的发展，环境保护成为越来越重要的话题，利用副产物设计新型高密度发酵培养基将越来越受欢迎。

3 乳酸菌高密度培养条件优化

除培养基的组成外，乳酸菌生长还受到一系列不同条件的影响，如温度和pH、通气和搅拌等。对乳酸菌生长营养物质和生长条件进行探索优化，不仅可以最大程度地提高生物量产量，还可以节约成本，有利于工业化应用。

3.1 pH 与温度

研究发现除碳源、氮源等营养物质显著影响乳酸菌生长外，pH 和温度是最重要的生长参数，对乳酸菌的生长温度和pH 进行优化对乳酸菌商业生产至关重要。乳酸菌生长的最适pH 范围为5.5～6.0，能在其他乳酸菌不能生长的酸性环境中生长繁殖。但乳酸菌在生长过程中会产生乳酸等，导致更低的pH 环境，对生长不利。实验室优化pH 的方法一般通过将初始pH 调整到菌体最适生长酸碱度环境，但工业化应用更加复杂，可能会涉及到生长过程的酸碱度变化，往往采用恒pH 培养、分批培养等方法保证生长最适pH 范围。pH 和温度的影响是紧密相连的，不同pH 条件下对应的最适温度也不一样，例如在探究乳酸菌调控餐厨垃圾剩余污泥发酵产乳酸的影响机制中，发现pH 越低所需的最适温度越高，pH 为11 时的最适温度是20 ℃，pH 为9 和7 时的最适温度分别是35 和50 ℃。

培养温度主要通过影响乳酸菌关键酶的活性发挥作用，在较高的生长温度下，可观察到能量代谢途径受到抑制，例如脂肪酸、核苷酸和氨基酸的生物合成，与氮和碳源吸收相关的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶（PTS）系统和ATP 结合盒式转运蛋白（ABC 转运蛋白）系统上调。理想的发酵温度可以加快发酵进程，非最佳温度下滞后期相当长，并且对乳酸菌的酶活性造成不利影响，导致更长的生产时间。除此之外，温度对乳酸菌生物量如乳酸的生产具有重要影响，DSM 20531T细胞生长在含淀粉的培养基中对温度具有很强的依赖性。所以在乳酸菌高密度培养条件的优化实验中，温度的优化是很重要的考虑条件，它能够增强生物活性和产生更高的生物量。

3.2 通气与搅拌

对乳酸菌生长的外部因素如搅拌、通气条件的研究也有助于生产高效能的益生菌制剂。乳酸菌是兼性厌氧型微生物，所以必须考虑气相环境对菌株生长的影响，与酸碱度、温度的影响效果不同，它可能会影响微生物的生长和代谢模式，只有降低环境中或菌株自身产生的活性氧的威胁，才能提高乳酸菌的存活力。乳酸菌在氮气等惰性气体条件下的生理活性、比生长速率、营养物质消耗速率和细胞存活率最高，发酵处于最优状态，最大活菌数可高达到1.8×10CFU/mL。研究表明通气方式也对益生菌的最大活菌数产生影响，乳杆菌R8 在间歇通氮气的条件下，菌体的终浓度最高，OD 值达到12 以上，在持续通氮气或用氮气保压的条件下，菌体终浓度比不通气时还低。

在乳酸菌液体高密度培养过程中，搅拌的作用是使中和剂与发酵培养液混合均匀，及时中和高密度培养过程中产生的酸，减少酸性物质的积累对菌体生长的抑制作用，同时增大培养物气液相的接触面积。搅拌速率不宜过大，以免对细胞产生较大的剪切力，损伤细胞，影响细胞活性。搅拌和通气有利于培养基的均匀性、底物的可用性、以及改变细胞代谢产物和生成氧转移的增加，是乳酸菌生物量生产的重要条件，Gutierrez-Sarmiento 等对BAL-03-ITTG 的搅拌条件和曝气条件等重要生长因素进行研究，发现在300 r/min 搅拌、0.13 vvm曝气条件下，乳酸菌的生长及生物量生产比未处理条件下高，首次为植物乳杆菌BAL-03-ITTG 在搅拌罐生物反应器中生长提供了有价值的信息。

4 乳酸菌高密度培养技术改进

对乳酸菌生长动力学模型进行分析，根据抑制因素的不同主要分为底物抑制模型和代谢产物抑制模型。底物浓度不足或过高都会限制细胞生长。同时在乳酸菌高密度培养过程中，会形成大量的乳酸等代谢产物，造成生长环境pH 降低，阻碍细胞生长。减少这些抑制因素对乳酸菌生长的影响，可实现乳酸菌的高密度培养。如表2 所示，分批培养技术是最常见的培养技术，通过调节生长的pH 环境，维持菌株增殖的稳态环境来促进乳酸菌高密度生长，通过补加新鲜培养基的分批补料培养技术可同时减少底物和产物抑制的影响。膜培养技术是在膜条件基础上，供给新鲜培养基的同时，定期除去发酵培养的低分子产物，更大程度地减少培养环境的压力，延长乳酸菌的生长时间。除此之外，固定化培养技术将乳酸菌细胞固定在特定的培养基质上，使其尽可能地远离培养环境带来的不利影响，为乳酸菌的生长提供一个相对稳定的环境，增强乳酸菌细胞的生长能力。

表2 乳酸菌高密度培养技术Table 2 Research methods for high-density cultivation of lactic acid bacteria

5 其它优化培养策略

单菌株的代谢途径和能力可能不够完善，共同培养、取长补短可以更好地发挥菌株的益生特性。在连续搅拌罐反应器（CSTR）和透析膜反应器中，混合培养和，研究表明对的生长具有强烈的促进作用，同时也可以将葡萄糖转化为的底物乳酸，生产丙酸盐和醋酸盐，实现丙酸较高的生产率。

改善菌株特性也是乳酸菌高密度培养的技术之一。对菌株进行驯化可以得到高糖耐受型、耐热型、耐盐型、耐酸型、耐冷型的乳酸菌菌株。通过基因工程进行重组也可得到耐受型或高产型的菌株。通过分析菌株的基因序列，对启动子进行优化也可以改变乳酸菌的糖代谢通路，增强对不同糖类的利用能力。物理手段超声处理也可以改变细胞的膜通透性，增加营养物质的运输。林杨等采用常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术，获得1 株蛋白酶活性稳定且高产酸的菌株Y8-6，为进一步开发相关优质乳酸菌资源及其在食品发酵工业中的应用奠定了基础。

6 总结与展望

乳酸菌高密度培养的显著优势在于能够以较低的发酵体积和较短的发酵周期获得较高的目标菌体密度。乳酸菌高密度培养是当前食品发酵工业研究的热点之一，也是实现乳酸菌发酵剂规模化生产与应用的重要目标和方向。乳酸菌高密度培养优化一般包括以下两个方面：一是通过培养基及培养条件的优化为乳酸菌的生长提供最合理的营养要素，在最佳生长条件下获得细胞最大化；二是通过控制培养方式，使菌株始终处于生长的最佳培养环境，延长乳酸菌生长的对数期和稳定期，获得高密度的细胞。

但仍有一些方向需要给予更多的关注和研究。首先，对高密度培养来说，基础培养基至关重要。它必须能获得大量高活力的菌体、培养后菌体需能够被分离出来且成本低廉。然而，由于菌体对生长要求具有特异性，部分菌体与培养基的分离也一直影响其是否能更好地被利用。另外，培养基的成本也是工业化应用的关键，虽然已有研究表明副产物有望作为乳酸菌生长的培养介质，然而还没有研究表明仅利用生物副产物就可实现乳酸菌的高密度培养，所以仍需对乳酸菌高密度培养的生长介质和生长条件进行探究。

其次，高密度培养的菌株种类和功能比较单一，不能满足实际生产和生活需求。已有的办法是从已知的生长环境中分离筛选所需要的目标菌株或利用新技术和新方法增强乳酸菌生物活性和生长能力，以便更加贴合实际发酵生产的要求，节省培养成本。但是乳酸菌市场应用日益广大，仍需开发探索不同种类和功能的乳酸菌。

最后，不同菌株的代谢途径或酶活性可能有所不同，需要对其产能方式进行探究，以便在高密度培养过程中，更好地优化影响生长过程的重要营养因素，延长细胞生长期，获得高密度的细胞。同时还能通过改变产生的代谢产物，减缓生长环境对细胞的压力，提高细胞繁殖活力。