基于熵权-层次分析法及反向传播神经网络多指标优化地黄水提物提取工艺

祝子喻，谢雨欣，俞月婷，张 梅

（省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，成都中医药大学药学院，四川成都 610000）

地黄（Libosch），玄参科植物的新鲜或干燥块根，具有清热凉血、养阴生津等功效。《神农本草经》中记载地黄有“久服，轻身不老”的作用，主要含有环烯醚萜类、苯乙醇苷类、糖类、核苷类等成分。中国国家卫生部于2002 年将其列入可用于保健食品的名单。地黄常以水煎的形式用于临床和生活中，研究表明地黄水提物对糖尿病、糖尿病性肌萎缩、抑郁症、骨质流失等疾病有潜在治疗效果，具有开发利用价值和研究意义。

目前地黄提取工艺研究多数仅以多糖、梓醇等单个成分含量作为评价指标，而以多项指标开展综合评价的工艺研究鲜见报道。研究表明，环烯醚萜苷类为地黄主要功效成分，其中梓醇、地黄苷D 和益母草苷不仅为地黄原型入血成分，还具有广泛的生理活性，如降糖、抗炎、抗肿瘤等，故本研究将这三种成分确立为评价指标。地黄多糖类成分具有抗炎、抑制血管钙化等作用，因此和水溶性浸出物一起被纳入评价指标。此外，相较于回流、浸提等传统提取方法，超声提取凭借其快速便捷，提取效率高等优势在地黄提取工艺中得到广泛使用。

多指标多因素提取工艺研究常采用正交试验设计，具有高效经济的优势，但存在取样点有限，不够全面的问题。客观赋权法熵权法（Entropy Weight Method，EWM）和主观赋权法层次分析法（Analytic Hierarchy Process，AHP）常应用于多指标问题研究，将两者结合，既能通过主观经验对指标重要性进行排序分配，又能客观反映指标信息，使权重系数更加科学合理。反向传播神经网络（Back Propagation Neural Network,BPNN）对此类多维非线性问题展现出良好解决能力，利用BPNN 建立模型，可以模拟范围内多个点，弥补正交试验的不足，从而进行全局寻优，更好地反映不同因素不同水平对提取物质量的影响。

因此，本研究以梓醇、地黄苷D、益母草苷、多糖含量及水溶性浸出物为评价指标，引入EWM 和AHP 确定权重系数，利用BPNN 在正交试验基础上建立模型，从而多维度评价并优化地黄水提物提取工艺，为相关研究提供新思路和新案例。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地黄药材 2021 年7 月购于四川省成都市荷花池市场，经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定为玄参科植物地黄（Libosch.）的干燥根茎，生产批号：20 210703；梓醇对照品（批号MUST-18103011，纯度≥98%）成都曼思特生物科技有限公司；地黄苷D 对照品（批号DSTDD010701，纯度≥98%）、益母草苷对照品（批号DSTDY016301，纯度≥98%）乐美天医药德思特生物有限公司、D-葡萄糖对照品（批号PS1231-0100，纯度≥98%）成都普思生物科技股份有限公司；乙腈 色谱纯，美国fisher 公司。

TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9023A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；JY-10 型超声波清洗机 湖北鼎泰生化科技设备制造有限公司；BT25S 型十万分之一电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC 法测定梓醇、地黄苷D、益母草苷含量

1.2.1.1 色谱条件 根据参考文献[24]，色谱柱为中谱AQ-C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～10 min，1%乙腈；10～13 min，1%～4%乙 腈；13～31 min，4%乙 腈；31～34 min，4%～1%乙腈；波长：203 nm；流速0.8 mL/min，进样量10 μL，理论塔板数不低于5000。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 分别取梓醇、地黄苷D 和益母草苷对照品适量，精密称定，置于5 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得梓醇、地黄苷D 和益母草苷浓度为3.045、0.580、1.750 mg/mL 的对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 综合参考文献[11,25-26]，取粉碎后过60 目筛的细粉，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 水，称定重量，在超声功率40 kHz，超声温度60 ℃下提取1 h，室温下放冷，再称定重量，用纯水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液1 mL，即得。

1.2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取“1.2.1.2”项下的对照品溶液，将其分别稀释0、2、4、8、16、32 倍，再分别吸取10 μL 于高效液相色谱仪测定，以各待测成分的峰面积（y）对进样浓度（x，μg/mL）绘制标准曲线。

1.2.1.5 方法学考察 结合参考文献[24]，对HPLC法进行精密度、重复性、稳定性、加样回收率的方法学考察。

1.2.1.6 含量测定 取各提取物溶液，在上述所建立色谱条件下进行HPLC 测定，记录峰面积。根据线性回归方程，采用外标法根据下方公式计算3 个成分的含量。

式（1）中，：指标成分含量，mg/g；C：通过线性回归方程得到的指标成分质量浓度，mg/mL；D：各指标成分供试品的稀释倍数；m：各供试品称样量，g。

1.2.2 紫外分光光度法测定多糖含量 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，取D-葡萄糖对照品适量，精密称定并定容至25 mL，得每1 mL 含D-葡萄糖119.2 μg的对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水至2 mL，加入5 %苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，放冷至室温，再置90 ℃水浴中加热15 min，取出，冷却5 min。以相应试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法，在490 nm 的波长处测定吸光度，以浓度（X）对吸光度（Y）作线性回归。根据参考文献[25]制备供试品溶液，取1.2.1.3 项下滤液1 mL，加入4 倍量的无水乙醇，在4 ℃冰箱中醇沉12 h，5000 r/min 离心过滤10 min，将得到的多糖沉淀加50 ℃热水溶解，定容至5 mL 即得。同时根据上述条件进行精密度、重复性、稳定性、加样回收率的方法学考察。

取供试品溶液适量，依法测定吸光度，供试品多糖含量按照下式计算。

式（2）中，：多糖成分含量，mg/g；C：通过多糖线性回归方程得到的多糖质量浓度，mg/mL；D：多糖的稀释倍数；m：各供试品称样量，g。

1.2.3 水溶性浸出物得率测定 精密吸取各提取液，置烘干恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱105 ℃干燥3 h，取出后置干燥器中冷却30 min 迅速称重。水溶性浸出物的质量和原药材质量的比即为水溶性浸出物得率，按照下式计算。

式（3）中，：水溶性浸出物得率，g/g；M：水溶性浸出物质量，g；m：各供试品称样量，g。

1.2.4 地黄水提物提取工艺单因素实验 因为梓醇和多糖为地黄常见有效成分，因此单因素考察选择梓醇、多糖含量作为评价指标，固定因素水平为提取温度为60 ℃，提取1.0 h，料液比1:25 g/mL，在进行单因素考察时，保持其他固定水平不变，分别考察不同料液比（1:10、1:25、1:50、1:100 g/mL）、超声温度（50、55、60、65、70 ℃）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）对梓醇、多糖含量的影响。

1.2.5 地黄水提物提取工艺正交试验优化 基于单因素考察结果，确定地黄正交工艺考察因素水平，以梓醇、地黄苷D、益母草苷3 种指标成分含量，地黄多糖含量，水溶性浸出物得率为综合评分指标，设计正交试验（表1）。制备提取液供试品，按“1.2.1.6”“1.2.2”“1.2.3”项下方法测定各部分指标。

表1 地黄提取工艺正交试验因素水平Table 1 Factors level of orthogonal test of Rehmannia glutinosa extraction process

1.3 数据处理及实验验证

每个实验均平行3 次；数据绘图采用Origin 2022学生版软件；方差分析使用SPSS 25 软件；EWM、AHP法以及EWM-AHP 法使用Microsoft Excel 2016 计算；BPNN 模型采用MATLAB R2016b 建立并分析。

1.3.1 EWM 法确定权重 EWM 法确定权重需要经过标准化（式4），归一化（式5），计算信息熵（式6），最后得到指标权重（式7）。

式中，Y表示第i 次实验时第j 个评价指标标准化后的值，Y表示第i 次试验时第j 个评价指标的归一化值，n 表示试验次数，S表示第j 个评价指标的信息熵值，W表示第j 个评价指标的熵权值。

1.3.2 AHP 法确定权重 AHP 根据各指标重要性主观赋予数值，将复杂多指标系统层次化后再通过逐层比较进行分析。在计算中，一致性比值（Consistency Ratio,CR）小于0.1 表明矩阵具有一致性，数值设置以及权重系数可靠。按照常见指标成分及其重要性进行排序：梓醇=多糖＞地黄苷D＞益母草苷＞水溶性浸出物，并赋值组成判断矩阵A（表2）。根据参考文献[30]，先将判断矩阵每一列归一化（式8），随后按行相加（式9），再将得到的结果归一化（式10）可得所求的权重向量。通过计算判断矩阵的最大特征根（式11）进而求出CR 值（式12）。

表2 指标成对比较的判断优先矩阵Table 2 Judgment precedence matrix for paired comparison of indicators

式中，a表示判断矩阵A 中第i 行第j 个指标的值；a表示判断矩阵A 第j 个指标所在第K 列的求和值；K 表示列数；m 表示指标成分个数；q表示a 矩阵中第i 行第j 个指标的按列归一化后的值；r表示将q 矩阵第i 行相加的值；r表示将q 矩阵第j 行列相加的值；r 表示所求的权重值；λ表示判断矩阵A 的最大特殊根；CR 表示一次性比值；1.12 为常数，表示m=5 时的平均随机一致性指标。

1.3.3 EWM-AHP 法确定权重及综合得分计算 按下式计算EMW-AHP 法复合权重，并通过复合权重计算提取物综合得分。

式中：r 和w分别为EWM 及AHP 法所得权重系数；F表示各个相应指标的EWM-AHP 复合权重。

式中，Z 代表EWM-AHP 复合评分，F代表各指标相对应的EWM-AHP 复合权重。

1.3.4 BPNN 优选工艺 使用MATLAB R2016b 软件进行BPNN 建模以及工艺寻优，本实验使用3 层结构BPNN，输入节点为正交考察工艺因素，输出节点为EWM-AHP 法综合得分，构建网络并训练，以实测值和网络预测值进行回归分析评价模型性能。根据正交考察因素，设置不同的输入，通过建立的BPNN映射关系进行评分预测，选择最高评分为BPNN 优选工艺。

1.3.5 提取工艺验证 以BPNN 优选工艺及正交试验优选工艺为基础，分别平行提取3 份，筛选最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 梓醇、地黄苷D、益母草苷以及多糖含量测定

2.1.1 梓醇、地黄苷D、益母草苷、多糖线性关系“1.2.1.1”项色谱条件下对照品及样品的色谱图显示梓醇、地黄苷D、益母草苷在检测波长下分离良好，与对照品保留时间相同，见图1。

图1 地黄供试品溶液（A）与混合对照品溶液（B）HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of test solution (A) and mixed reference solution (B) of Rehmannia glutinosa注：1.梓醇；2.地黄苷D；3.益母草苷。

“1.2.1.4”以及“1.2.2”项下分别得到梓醇、地黄苷D、益母草苷、多糖的回归方程、相关系数（）及线性范围，见表3，显示梓醇、地黄苷D、益母草苷分别在0.034～1.047、0.037～1.141、0.048～1.390 mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，多糖在0.005096～0.05960 mg/mL 范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

表3 线性关系考察结果Table 3 Linear relationship examination results

2.1.2 梓醇、地黄苷D、益母草苷、多糖方法学考察结果 “1.2.1.5”以及“1.2.2”项下测得梓醇、地黄苷D、益母草苷、多糖的精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果见表4。结果表明梓醇、地黄苷D、益母草苷以及多糖含量测定方法的精密度和重复性良好，供试品溶液在12 h 内稳定，加样回收率合格，方法可靠，符合定量分析的要求。

表4 精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果Table 4 Precision,repeatability,stability and recovery results

2.2 单因素实验

如图2A 所示，随着料液比的增加，梓醇和多糖含量均呈现先上升后下降的趋势，推测可能是料液比增加到一定程度后，二者物质溶出达到限量，而当料液比过高时，物质与溶出的杂质充分接触，结构发生变化，从而导致含量下降。梓醇在料液比1:50 g/mL时达到峰值，多糖在料液比1:25 g/mL 的时候达到峰值，由于梓醇含量变化趋势较大，多糖含量变化趋势较小，选择1:25、1:50、1:100 g/mL 进行后续考察。

如图2B 所示，随着时间的增加，提取物中梓醇含量呈现先上升后下降的趋势，在1 h 时梓醇含量达到峰值，结合田春莲等的研究，推测可能是因为梓醇不稳定，超声时间越长越容易破坏结构。多糖含量随时间变化略有上升，在2 h 达到峰值后下降，与张骆琪等的结果一致，但其含量波动不明显，综合考虑，选择0.5、1、1.5 h 进行后续考察。

如图2C 所示，提取物中梓醇含量随温度增加而上升，60 ℃后趋于下降，梓醇对热不稳定，超声温度过高可能会导致梓醇分解，这一现象与熊辉等研究结果一致，而多糖含量在这几个温度下无较大差异。因此，选择50、55、60 ℃进行后续考察。

图2 单因素实验结果Fig.2 Results of single factor study

2.3 正交试验优化工艺

EWM 最大优点是避免了主观因素，得到的权重更具客观性。AHP 法优势在于定量表达评价人员的主观判断。基于单因素考察结果，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为考察因素，D 项为设置的误差项。正交试验各指标含量结果见表5。EWM 法、AHP 法以及EWM-AHP 法所得多指标权重系数见表6。比较EWM 法、AHP 法以及EWM-AHP 法三者得到的权重系数值发现，EWM 法虽避免了人为影响因素，但地黄苷D 权重数值过大，忽视了指标间的轻重关系；AHP 法中梓醇和多糖的权重远高于水溶性浸出物，可能是因为矩阵中的“倒数”赋值而出现的“意见放大”现象。二者结合以后，降低了单一方法带来的分析偏差，使评分更全面、公正、符合实际。

表5 地黄提取工艺L9(34)正交试验结果Table 5 Orthogonal test results of extraction technology L9(34)of Rehmannia glutinosa

表6 EWM、AHP、EWM-AHP 法权重系数Table 6 EWM,AHP and EWM-AHP weight coefficient

表7 显示，运用EWM-AHP 复合评分结果分析C＞A＞B，即各因素对EWM-AHP 复合评分的影响为料液比＞提取温度＞提取时间。由A＞A＞A，B＞B＞B，C＞C＞C可知最佳工艺为ABC，即每1 g 地黄粉末，用25 mL 纯水提取，在提取温度50 ℃条件下提取1 h。方差结果（表8）表明，各因素对EWM、AHP 法以及EWM-AHP 法中综合评分影响程度较小，无显著性差异＞0.05。

表7 EWM -AHP 法复合评分的正交结果Table 7 Orthogonal results of EWM-AHP composite scoring method

表8 方差分析Table 8 Analysis of variance

2.4 BPNN 数据分析

2.4.1 BPNN 模型建立 本实验采用3 层结构的BPNN 建立模型，输入节点数为3 个，即超声温度（A）、超声时间（B）、料液比（C），输出节点数为1 个，即综合评分。原理见图3。

图3 BPNN 结构示意图Fig.3 Schematic diagram of BPNN structure

2.4.2 BPNN 网络训练及参数 采用上述确定的BP 网络结构，使用MATLAB R2016b 软件的神经网络工具包，建立工艺参数矩阵为输入，综合评分矩阵为输出，其余采用默认设置，成功建立一个隐含层为10 的BP 模型，得到各因素水平与地黄多指标评分的映射关系。网络的训练均方误差曲线见图4，正交数据实测值与预测值的比较见图5，表明该网络模型性能良好，能够有效预测不同工艺下地黄提取物的综合得分。

图4 BPNN 均方差Fig.4 Mean square error of BPNN

图5 BPNN 可靠性验证Fig.5 Reliability verification of BPNN

2.4.3 BPNN 预测最佳工艺 BPNN 应用广泛，具有优良的映射能力，可对多维非线性因素进行仿真模拟以及筛选优化，将其与传统正交试验结合，基于少量实验数据即可准确预测范围内的所有条件，简单便捷。在正交试验参数基础上，设置地黄提取物提取温度50～60 ℃（步长5 ℃），提取时间30～90 min（步长10 min），料液比0.04（1:25 g/mL）～0.01（1:100 g/mL）（步长0.01），通过所建立的模型计算复合评分，预测评分结果见表9，将分数从低到高排列。从表中可以看到，三种因素的交互影响导致预测评分变化的复杂性，选择表7 EWM-AHP 复合评分中的最高评分94.71 为最小值进行筛选后分析（表9 序号78～84），可以看出，随着超声温度的上升，超声时间也随之延长才能保持分数稳定；当料液比为0.03（1:33 g/mL）时，分数数值稳定且高分数量明显多于其他参数。BPNN 预测最佳工艺为料液比1:33 g/mL，在60 ℃下超声70 min。

表9 BPNN 预测数据Table 9 Prediction data of BPNN

2.5 工艺验证

正交试验所得最佳工艺参数为提取温度50 ℃，加25 倍水，提取1 h；BPNN 优化工艺为在60 ℃下，加33 倍水，提取70 min。二者验证结果见表10，比较发现BPNN 优化工艺评分最高，表明BPNN 预测结果较为可靠，可用于提取工艺优化。

表10 工艺验证结果（,n=3）Table 10 Process verification results (,n=3)

3 结论

本研究选择地黄中三种有效成分梓醇、地黄苷D、益母草苷以及多糖、水溶性浸出物为评价指标，在单因素考察基础上进行正交试验，通过EWMAHP 法得到各指标对应权重，计算综合得分，再利用BPNN 在正交结果上进行建模。比较BPNN 以及正交试验优选工艺，结合验证发现BPNN 优选工艺最优，即在60 ℃下，加33 倍水，提取70 min，综合得分为97.74。研究结果表明，BPNN 模型预测可靠，可有效优化提取工艺，为提取物工艺优化提供了新的研究思路。