微滴式数字PCR 定量检测欧洲甜樱桃中掺假苹果成分的研究

陈 佳，秦 丽 ，刘 浩，杨 帛，张凯江，赵冬梅，郭金颖，张媛媛,

（1.石家庄学院化工学院，河北石家庄 050035；2.河北省知识产权保护中心，河北石家庄 050000；3.秦皇岛市食品药品检验中心，河北秦皇岛 066001）

樱桃为蔷薇科李属樱桃亚属（L.）植物，起源于里海和黑海，又名莺桃、荆桃、楔桃、英桃、牛桃、樱珠，是世界温带地区的一种重要水果。欧洲甜樱桃汁具有独特的酸味、富含花青素和花色苷等黄酮类物质，具有清除自由基的作用。美国路易斯安娜州立大学农业中心的研究表明，欧洲甜樱桃果汁在改善睡眠时间和睡眠质量方面有显著效果。据不完全统计，国际上基于不同程度的掺假现象占50%～80%左右，为牟取利益，商家往往在高附加值水果果汁中进行掺假，且水果制品中掺假现象也屡见不鲜。利用颜色、味道等因素在欧洲甜樱桃果汁中添加低价果汁，有的甚至会添加廉价糖和有机酸等。易敏体质人群可能会因食用未标识植物源性添加物后引起过敏反应，严重的还会发生中毒反应。如用葡萄柚汁代替橙汁可能会导致严重的药理相互作用。以上种种掺假现象严重破坏了市场的运行机制。

针对市场中常见的以低价替代品掺入高价值食品中的现象，国内外学者对此进行了大量的研究，确定多种鉴别手段，如感官鉴定法、理化法以及分子生物学方法等。马泽亮等设计了一套基于电子鼻和电子舌的新型智能感官检测系统，并将其应用于果汁纯度鉴定中，实现了对橙汁纯度的定量检测。ZHANG等根据不同果汁中黄酮类、花色苷类等特征性物质的差别利用代谢组学方法可实现对蓝莓汁、蔓越莓汁及掺加苹果汁、葡萄汁的伪品鉴别。WANG等通过使用气相色谱和质谱数据集，在主成分分析评分图中成功地将100%柠檬汁样品与含有30%柠檬汁的掺假样品区分开来。CHEN 等利用ddPCR定量检测出添加在牛肉制品中的鸭肉成分，检出限为10%。苗丽等利用ddPCR 技术建立了羊肉质量和拷贝数的关系，检出限为10%。杨硕等应用多重数字PCR 技术定量鉴定出了核桃露中的核桃、大豆成分。现代分子生物学以其高特异性等优势在掺假鉴别中应用广泛，主要技术有聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术、实时荧光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技术、数字PCR（digital PCR，dPCR）技术等。微滴式数字PCR 技术是一种新型的可以绝对定量核酸的新型技术手段，数字PCR 是将含有核酸模板的PCR 反应体系分配到很多反应单元中进行核酸扩增，反应结束后收集每个反应单元的荧光信号，分析后得出样品中核酸浓度的一种技术。此技术直接检测样品中核酸的原始浓度，不依赖标准曲线和标准品，与传统荧光定量PCR 相比，数字PCR 的灵敏度和精确度更高。

本文采用微滴式数字PCR 技术针对欧洲甜樱桃源性成分设计特异性引物，建立了欧洲甜樱桃制品的数字PCR 定量检测方法进行掺假检测，克服了马泽亮等依赖于一定的人为主观因素，不能实现样本的绝对定量及ZHANG 等、WANG 等、CHEN 等、苗丽等掺假检测检出限较高的弊端。实现了绝对定量和5%的检出限。并根据市场上欧洲甜樱桃果汁及其制品的分类、添加物进行综合分析选取添加苹果汁建立掺假模型并验证方法的准确性，为欧洲甜樱桃果汁以及高附加值浆果的掺假鉴定和质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

欧洲甜樱桃、苹果原料及欧洲甜樱桃果汁及制品 购自石家庄市大型超市、农贸市场和网络平台；深加工食品DNA 提取试剂盒（非离心柱型）、天根商品化试剂盒、三氯甲烷 北京酷来博科技有限公司；ddPCR 实验耗材 美国Bio-Rad 公司。

AdVantage Pro 真空冷冻干燥机 美国VirTis公司；A11BS25 分析研磨机 德国IKA 公司；Sigma 3K15 冷冻离心机 德国Sigma 公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白测定仪 美国Thermo 公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR 扩增仪、DG8 cartridge 微滴生成卡、Holder 微滴发生器 美国Bio-Rad 公司；BCD 235STCY 冰箱 青岛海尔股份有限公司；SHAB 水浴恒温振荡器 常州润华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 购自超市、农贸市场的实验所用鲜果均用果实部分，鲜果先进行去皮去核处理，后进行真空冷冻干燥处理，将干燥后的浆果实验样品在分析研磨机中进行组织研磨处理，浆果实验样本分开处理，避免交叉污染，确保实验样本的准确性，市售样本的处理方式按相同方法进行处理。

1.2.2 基因组DNA 的提取 基因组DNA 的提取采用深加工食品DNA 提取试剂盒的改良版。a.欧洲甜樱桃与苹果各称取5、10、20、30、40、50 mg，向其中加入500 μL GMO缓冲液（Buffer GMO）与40 μL（20 mg/mL）蛋白酶K（Proteinase K），涡旋混匀1 min。60 ℃孵育2 h。孵育过程中始终保持振荡（1500 r/min）。b.加入GMO缓冲液（Buffer GMO）200 μL，三氯甲烷400 μL，混匀后静置10 min。c.12000 r/min离心5 min（4 ℃），转移上清。d.加入0.7 倍上清液体积的异丙醇，混匀，12000 r/min 离心5 min（4 ℃），留沉淀。e.加入700 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，在离心机上以12000 r/min 离心2 min，去除上清液。重复此步骤一次。f.开盖，彻底晾干残留乙醇。g.加入50 μL TE 缓冲液，混匀，测定DNA 含量和纯度。

1.2.3 引物设计 本实验所用引物均通过NCB 数据库（National Center of Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）寻找到其各个物种的特异性基因序列，根据欧洲甜樱桃、苹果浆果源性的多个靶基因序列设计了多对引物，具体引物及筛选结果见表1。引物设计由软件DNAman 和Primer5.0 得到，所设计的探针5′端和3′端分别采用FAM 荧光基团和TAMRA 淬灭基团进行修饰。

表1 浆果实验所需引物和探针Table 1 Primers and probes required for berry experiments

1.2.4 微滴式数字PCR 反应 反应条件：数字PCR反应条件包括2×ddPCR Super Mix 为10 μL、上游引物的用量为1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物的用量为1.2 μL（10 μmol/L）、探针的用量为0.4 μL（10 μmol/L）、DNA 模板为4.0 μL、ddHO 3.2 μL。反应程序：95 ℃预变性，10 min；94 ℃变性，1 min；56 ℃退火，45 s；进行40 个循环，98 ℃，10 min；4 ℃保存。

宪法学研究要立足于新时代坚持和发展中国特色社会主义的伟大实践。积极回应社会发展中重大的宪法关切，更加注重原创性和本土性研究，把宪法学的宏大叙事与具象表达、研究的开放性与自主性结合起来。坚持中国特色社会主义的政治优势和制度优势，努力提炼并不断丰富发展具有中国特色和中国气派的宪法学理论体系、概念体系、话语体系，不断增强中国宪法学的解释力、传播力和影响力。

操作步骤：a.先将所需实验模板按一定梯度进行稀释，制成实验样品转移到微滴发生卡中，同时加入微滴发生油70 μL，放入微滴发生器中，进行微滴化处理。b.将制备好的微滴转移到96 孔板中，应用封膜仪进行封膜处理。c.将封好膜的96 孔板，放到PCR 扩增仪中扩增。d.扩增结束后将96 孔板放到QX200 Droplet Reader 中，根据实际实验排版进行信息录入，读取实验结果，根据微滴发出的荧光信号的强度判定阳性和阴性结果，并记录下每个样品的阳性和阴性的微滴数。信号采集完毕后，软件Quantasoft将计算出最终结果并以图像形式给出。

1.2.5 特异性检测 实验所需物种均设计多对引物，经筛选得到最优引物。在特异性检测实验中，欧洲甜樱桃和苹果分别作为目标物种，杏、苹果、桃、梨、欧洲甜樱桃、葡萄、树莓、小樱桃、蔓越莓、黑加仑作为非目标物种，无菌双蒸水作为空白对照。

1.2.6 质量与拷贝数关系曲线的建立

1.2.6.1 欧洲甜樱桃及苹果两种浆果质量与提取DNA浓度的关系 欧洲甜樱桃和苹果实验样本各称5、10、20、30、40、50 mg，进行基因组DNA 的提取，每个质量重复3 次，减少实验误差，经Nanodrop 2000测定DNA 的含量，从而建立质量和其DNA 浓度之间的关系。

1.2.6.2 欧洲甜樱桃和苹果DNA 浓度与数字PCR的拷贝数关系的建立 将提取得到的欧洲甜樱桃基因组DNA 进行系列稀释，稀释梯度为5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，苹果基因组DNA 进行系列稀释，稀释梯度为5、10、20、40、60 ng/μL，每个梯度设置3 个重复，为得到准确的拷贝数，需对其稀释的精确性有较高要求，以无菌双蒸水作为对照，得到不同稀释梯度下的拷贝数，从而建立DNA 浓度和其拷贝数之间的关系。

1.2.7 掺假模型的建立 在欧洲甜樱桃掺假模型的建立中，欧洲甜樱桃为主要被掺假对象，苹果为掺假对象，掺假模型以50 mg 为最大掺假质量进行设计，欧洲甜樱桃与苹果掺假比例为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。之后将掺假的试验样本进行DNA 提取，并将提取好的基因组DNA 进行10 倍稀释，取4 μL 进行微滴式数字PCR 检测，所得结果通过公式推算出实际值和测量值的差异，进而衡量所建立公式的准确性。

1.2.8 市售样本分析 本文选自市场上常见欧洲甜樱桃果汁及制品进行掺假实验验证，实验前处理、基因组提取、稀释等方法均与上文样本保持一致。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 特异性检测

基于ddPCR 技术，选择常见不同浆果物种作为DNA 模板对本研究选用的引物进行特异性检测分析。结果显示本文选用的欧洲甜樱桃、苹果的引物和探针与杏、桃、梨、葡萄、树莓、小樱桃、蔓越莓、黑加仑不存在交叉反应，特异性良好（如图1～图2），可用于实验的测定。

图1 欧洲甜樱桃引物特异性筛选Fig.1 Screening of cherry specific primers

图2 苹果引物特异性筛选Fig.2 Screening of apple specific primers

2.2 质量和DNA 提取含量的关系曲线

分别称取欧洲甜樱桃和苹果的6 个质量梯度（5、10、20、30、40、50 mg），每个质量梯度设置三个重复，应用Nanodrop2000 对其提取的基因组DNA进行测定，得到质量和DNA 含量的线性拟合曲线。结果显示欧洲甜樱桃和苹果在其质量范围内与提取的基因组DNA 含量线性关系良好。如图3～图4 所示，欧洲甜樱桃和苹果的决定系数分别为0.9972、0.9977，由以上欧洲甜樱桃和苹果的相关性系数可知均在0.99 以上，说明数据具有一定的准确性，质量和DNA 浓度拟合曲线线性良好。

图3 欧洲甜樱桃质量和DNA 浓度的关系Fig.3 Relationship between mass and DNA concentration of cherry

图4 苹果质量和DNA 浓度的关系Fig.4 Relationship between mass and DNA concentration of apple

2.3 DNA 含量和拷贝数的关系曲线

将提取的欧洲甜樱桃基因组DNA 分别梯度稀释为5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，苹果的DNA梯度稀释为5、10、20、40、60 ng/μL，取4 μL 进行数字PCR 检测，进行三次重复，ddPCR 检测结果见图5。取其DNA 拷贝数均值进行线性拟合分析，欧洲甜樱桃和苹果DNA 拷贝数均随DNA 含量的增加而增加，两者呈现一定的线性关系（如图6～图7），欧洲甜樱桃和苹果的线性决定系数分别为0.9991、0.9946。

图5 梯度DNA 含量条件下欧洲甜樱桃（a）、苹果（b）的拷贝数图谱Fig.5 Copies number map of cherry (a) and apple (b) under gradient DNA content conditions

图6 欧洲甜樱桃DNA 浓度和DNA 拷贝数之间的关系Fig.6 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of cherry

图7 苹果DNA 浓度和DNA 拷贝数之间的关系Fig.7 Linear relationship between DNA copy number and nucleic acid concentration of apple

2.4 质量与拷贝数公式的建立

根据欧洲甜樱桃模板样品质量和DNA 含量得到一条线性曲线为y=14.455x+27.584，²=0.9972，其中，x 为欧洲甜樱桃的质量M（mg），y 为欧洲甜樱桃DNA 浓度（ng/μL）。由DNA 含量与拷贝数得到另一条线性曲线即y=8.3063x+23.218，²=0.9991，其中，x 为欧洲甜樱桃DNA 浓度（ng/μL），y 为欧洲甜樱桃DNA 拷贝数（copies/μL），其中再以DNA 含量为中间值进行换算时，DNA 浓度先经过了10 倍稀释，再取4 μL 进行计算，由此得到质量及DNA 拷贝数之间的线性关系，以DNA 含量为中间值换算得到欧洲甜樱桃质量与DNA 拷贝数之间的计算公式，欧洲甜樱桃：M=0.0833C-3.8420。同理，苹果：M=0.4084C-1.5747，其中，M 代表植物源性成分的质量（mg），C 代表每微升的拷贝数（copies/μL）。

2.5 掺假模型的数字PCR 检测

在欧洲甜樱桃的掺假模型中，共设置9 个掺假比例，分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1。称取已知混合比例的掺假模型并提取基因组DNA。为验证本方法的适用性和准确性尽可能模拟市售样品中存在的掺假情况。取4 μL 稀释10 倍的基因组DNA 进行检测，进行三次重复，并将测得的拷贝数均值代入公式中得到目标物种的质量。结果如表2～表3 显示，欧洲甜樱桃与苹果的掺假模型中相对误差最大为-19.17%，所得结果均在统计学25%许可范围内。通过分析实验数据可知，本研究所建立的欧洲甜樱桃、苹果ddPCR 定量方法可有效应用于市售制品的检测。

表2 已知比例欧洲甜樱桃与苹果掺假模型樱桃分析结果Table 2 Analysis results of cherries with known proportion of cherries and apple adulteration model

表3 已知比例欧洲甜樱桃与苹果掺假模型苹果分析结果Table 3 Analysis results of apple with known proportion of cherries and apple adulteration model

2.6 市售样本分析

通过对市场上市售浆果样本检测结果（见表4）分析可知：欧洲甜樱桃市售样本存在掺假情况，其中，样品Y-1 中测得欧洲甜樱桃含量为0，苹果源性15.37%，样品Y-2 中测得欧洲甜樱桃含量为0，苹果源性0，样品Y-3 中测得欧洲甜樱桃含量为0，苹果源性3.17%，样品Y-4 中测得欧洲甜樱桃含量为0，苹果源性4.15%。通过对市售样本的检验，说明标称含有欧洲甜樱桃成分的果汁中存在掺假现象，应进一步开展相关检测工作以保障食品安全，同时，也验证了本实验所建立的定量检测掺假方法具有一定的实用性和适用性。

表4 市售样品分析结果Table 4 Commercial sample analysis results

3 结论

本文采用微滴式数字PCR 技术对浆果中欧洲甜樱桃品种进行掺假定量检测，通过欧洲甜樱桃和苹果两种浆果的质量及其DNA 含量，DNA 含量及其扩增DNA 拷贝数之间的线性拟合关系，得到欧洲甜樱桃和苹果两种浆果的质量和扩增DNA 拷贝数的计算公式：M=0.0833C-3.8420、M=0.4084C-1.5747，从而可以快速鉴别欧洲甜樱桃的掺假情况。

为进一步验证方法的准确性，构建欧洲甜樱桃掺假模型，计算欧洲甜樱桃的实际掺入量，经扩增得到的实验值和实际加入的掺假质量相差不大，最大相对误差为-19.17%，都在误差范围内，上文所述欧洲甜樱桃数据变异系数小，说明数据具有一定的可靠性。

综上所述，微滴式数字PCR 技术能够准确地进行欧洲甜樱桃的定量检测，这为市场上果汁中欧洲甜樱桃掺假的定量问题提供了一种技术手段，同时本研究也为除欧洲甜樱桃、苹果这两种浆果之外的其它浆果的定量检测提供了一种检测方向，健全了定量检测体系。