猕猴桃和青菜病原真菌的分离、鉴定及生物学特性

李佩琪，江 山，戴 群，卫 蔚，林 洁,

（1.江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏省生物功能分子重点实验室，江苏南京 210013；2.南京理工大学环境与生物工程学院，江苏南京 210094）

果蔬因其富含糖类、维生素及蛋白质，具有很高的经济价值和营养价值，但常常会被病原菌侵染。据统计，由病原菌造成的折损占果蔬生产总折损的50%以上。果蔬中的病原菌包括细菌、真菌、病毒，它们都能引发果蔬病害。其中，真菌占病原菌中的70%～80%。目前，植物病原菌的防治方法主要有：使用抗病品种、化学防治和生物防治。使用果蔬抗病品种可以进行有效的防治，但研究周期长、难度大且抗性易丢失；化学防治是目前主要手段，但高效低毒的杀菌剂品种少、易造成环境污染；而生物防治具有良好的防治效果和前景，是当今研究的热点。了解植物病原菌是生物防治的前提。因此，研究植物病原菌的种类及性质对果蔬防腐具有重要意义。

猕猴桃（Planch.）是猕猴桃科猕猴桃属植物，因其口味独特、营养丰富而受到人们的青睐。然而，猕猴桃果实贮藏期间易于腐烂，采后腐烂率高达约35%。一直以来，有许多学者致力于猕猴桃病原菌的分离与鉴定，如Romanazzi发现可以引起的猕猴桃果实灰霉病，王忠肃等首次发现pv.是引起猕猴桃溃疡病的病原菌。Li 等认为葡萄座腔菌为猕猴桃软腐病优势致病菌。以上研究结果均表明，猕猴桃腐烂是由多种病原菌引起的，不同地域之间的优势菌株不尽相同，而大多数的研究对于猕猴头病原菌缺少致病性鉴定方面的实验。

青菜（var.）隶属十字花科芸苔属（L.），培植历史悠久，在我国各地均有栽培，而在江浙沪种植较多。芸苔属约含40 多个种，属内包含许多重要的蔬菜、油料及饲料作物。目前对该属中大白菜病害的研究较多，包括霜霉菌引起白菜霜霉病，链格孢属（）真菌引起白菜黑斑病，希金斯刺盘孢菌引起白菜炭疽病，假单胞菌属细菌sp.引起白菜角斑病，野油菜黄单胞属细菌引起白菜黑腐病，胡萝卜软腐果胶杆菌引起白菜软腐病等。但目前关于同属于芸苔属的青菜，研究工作主要集中在抗病性品种选育和品性分析方面，对于其病原菌，尤其是病原真菌的研究很少。

因此，本研究拟对猕猴桃和青菜这两种成分不同，但经济价值均高的果蔬进行病原真菌鉴定，并且对其病原真菌进行致病性及生物学特性进行研究，来探索不同品种的果蔬之间是否具有共性病原真菌，为果蔬的存储及病害的防治提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猕猴桃 2020 年3 月网购自陕西省西安市周至县的完整且无病害的猕猴桃，经扬州大学李熠教授鉴定为翠香猕猴桃品种（原代号西猕9 号）；青菜2020 年3 月网购自安徽省黄山市的完整且无病害的青菜，经扬州大学李熠教授鉴定为上海青品种；马铃薯葡萄糖琼脂培养基 杭州百思生物技术有限公司；乳酸石碳酸棉蓝染液 南京森贝伽生物科技有限公司；Lysis Buffe、DNA Marker（DL 2000）、Premix Taq

美谷生物科技有限公司；50×TAE 电泳缓冲液、Loading Buffer Solarbio；琼脂糖 西格玛奥德里奇贸易有限公司；引物ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′）和ITS5（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）南京金斯瑞生物科技有限公司；核酸染料生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2F 双人超净工作台、GZX-9240MBE 电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DNP61 电热恒温培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；YXQ-LS-70A 立式压力蒸汽灭菌器 南京博惠科学仪器有限公司；ESE6539TA 冰柜 海尔有限公司；BSA24S 分析天平 昆山艾思博格电子科技有限公司；DYY-6C 三恒多用电泳仪 北京市六一仪器厂；S1000 PCR 扩增仪 Biorad；TGL-16C 台式高速离心机 常州迈科诺仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 猕猴桃及青菜病原真菌的分离纯化 将购买的猕猴桃、青菜室温存放，等待其发病并观察发病情况；取样：在肉眼可见发生病害的猕猴桃果皮和青菜叶片的病健交界处切取大小为3 mm×3 mm 的组织块；消毒：用清水冲洗组织块，然后在超净工作台下进行组织块消毒（用75%的酒精中消毒30 s；用2%消毒水浸泡消毒30 s；用无菌水冲洗3～6 次；置于无菌滤纸上晾干）；分离培养：将消毒处理后的组织块置于PDA 固体培养基上（添加抗生素），此步骤要确保平板倒置后的组织块不会掉落，同时将最后一次漂洗的无菌水作对照，检验是否消毒合格；纯化培养：将培养基置于28 ℃智能生化培养箱培养3～5 d，待长出菌落后挑取菌落边缘少量菌丝，置于PDA 固体培养基中划线纯化，重复上述步骤，直至获得单一菌落；保种：将纯化后的菌株保存于PDA 斜面培养基上，同上培养直至菌落长出，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 致病性鉴定 实验材料为完整且无病害的猕猴桃和青菜，并且用75%酒精擦拭。用灭菌的针蘸取分离得到的菌株分别刺伤完整且无病害的猕猴桃和青菜上，每株菌三个平行。将接种好的猕猴桃和青菜置于灭菌的自封袋中，再放入28 ℃培养箱内，观察猕猴桃和青菜的发病情况。用灭菌的针蘸取0.85%的无菌生理盐水刺伤同样完整且无病害的猕猴桃和青菜作为空白对照。

1.2.3 猕猴桃及青菜病原真菌种属鉴定 形态学鉴定：用滴管吸取适量染液（乳酸石碳酸棉蓝）于载玻片上，用解剖针挑取少量菌丝置于染液滴上，随后将菌丝分散，盖上盖玻片，等待2～3 min。再将制作的玻片置于数码显微镜下40 倍观察。最后根据《真菌鉴定手册》工具书进行初步鉴定。

ITS 鉴定：在超净台中用灭菌牙签挑取肉眼可见的菌体加入到装有50 μL 的Lysis Buffer 的5 mL离心管中，充分混匀后在80 ℃水浴中孵育15 min，放冰上冷却。最后将1.5 mL 离心管在12000 r/min条件下离心30 s，取上清液用作菌落PCR 的模板。按照比例加入模板、引物、双蒸水和Taq 酶，再进行菌落PCR。使用1×TAE 缓冲液配制1.0%琼脂糖，倒入制胶槽内，冷却拔去梳子。点样孔每孔加入5 μL 的DNA 样品（含1 μL 的6×DNA Loading Buffer），对照孔加入5 μL Marker（DL 2000）作为分子量标准对照。稳压电泳（120 V，100 mA）约30 min。将跑完电泳的琼脂糖凝胶利用紫外线分析仪观察、照相。最后将PCR 产物送去南京思普金生物科技有限公司测序。利用MAGA 6.06 构建系统发育树进行分析并与真菌的形态学观察结果相互验证。

1.2.4 猕猴桃及青菜病原真菌的生物学特性研究

1.2.4.1 温度对病原菌菌落生长的影响 将7 株菌分别接种于PDA 培养基的圆心，分别放置于4、10、15、20、25、28 和30 ℃恒温培养箱中培养，每个温度重复三次。培养5 d 后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4.2 pH 对病原菌菌落生长的影响 用HCl 和NaOH 将PDA 培养基的pH 调成4、5、6、7、8、9和10。将7 株菌分别接种于不同pH 的PDA 培养基的圆心。每个pH 重复三次。培养5 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3 数据处理

试验数据显著差异性分析用Microsoft Excel 2016 软件进行，并采用GraphPad Prism 9.0.0 软件做图。采用MEGA 6.06 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃和青菜病原真菌的分离和纯化

从发病猕猴桃和发病青菜分离得到的菌落，纯化后得到7 株真菌，分别编号为M-1、M-2、M-3、M-4、Q-1、Q-2 和Q-3（图1），其中M-1、M-2、M-3和M-4 从发病猕猴桃中分离得到，Q-1、Q-2 和Q-3从发病青菜中分离得到。

图1 7 株真菌的菌落形态Fig.1 Colony morphology of seven strains of fungi

2.2 致病性鉴定结果

将从猕猴桃中分离出的病原菌M-1、M-2、M-3 和M-4 用针刺法分别接种于完整且无病害的猕猴桃上。5 d 后，猕猴桃产生发病症状（图2A～2D），而对照组无发病情况（图2E）。将从青菜中分离出的病原菌Q-1、Q-2 和Q-3 用针刺法分别接种于完整且无病害的青菜上，5 d 后青菜产生发病症状（图2F～2H），而对照组无发病情况（图2I）。研究发现7 株病原菌均能相应的引起这两种果蔬腐烂：接种M-2、M-3 和M-4 菌株的猕猴桃的发病部位出现黑色水浸状病斑，果皮着生大量白色绒毛状菌丝，与原始的发病症状近一致，而接种M-1 菌株的猕猴桃发病部位呈现半透明状态，果皮消失，并出现少量白色绒毛状菌丝，与原始的发病症状存在差异；接种Q-1、Q-2 和Q-3 菌株的青菜的发病部位出现黑色病斑，腐烂部位呈现半透明状态。

图2 7 株病原菌分别接种后猕猴桃和青菜的发病症状Fig.2 The symptoms of kiwifruit and vegetable after inoculation with 7 strains of pathogenic bacteria respectively

2.3 猕猴桃及青菜病原真菌的种属鉴定

2.3.1 形态学鉴定结果 对7 株病原菌进行显微观察（图3）后发现，Q-3 和M-3 的显微特征相似，为同一属的菌株。其他5 种菌株的显微特征各异。结合《真菌鉴定手册》（表1～表2）发现，这7 株菌为6 种，隶属2 门、5 目、6 科、6 属。菌Q-1 和Q-2 都为半知菌亚门，菌Q-3、M-1、M-2、M-3 和M-4 都为盘菌亚门（其中菌M-1 和M-4 同为粪壳菌纲）。

表1 猕猴桃及青菜病原真菌显微特征Table 1 Microscopic characteristics of pathogenic fungi of kiwifruit and pakchoi

表2 猕猴桃及青菜病原真菌鉴定结果Table 2 Identification of pathogenic fungi in kiwifruit and pakchoi

图3 7 株病原真菌的形态特征Fig.3 Microscopic observation characteristics of seven pathogenic fungi

2.3.2 分子鉴定结果 病原真菌ITS 片段的PCR 扩增结果：以获得的7 株病原真菌的基因组DNA 为模板，以ITS4 和ITS5 为通用引物，进行PCR 扩增，随后将扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。可以看出PCR 扩增得到的片段长度大小为500～750 bp且无杂带（图4），符合测序要求。

图4 PCR 扩增序列电泳图Fig.4 Electrophoretic image of PCR amplification sequence

测序结果：将经公司测序得到的病原真菌的序列录入NCBI 进行Blast 序列比对，并将病原真菌的序列与对比得出的同源性序列在MEGA 6.06 软件上用邻近法构建系统发育树。（图5）。M-1 位于壳囊孢属（sp.）分支，M-2 位于波兰青霉（）分支，M-3 与Q-3 同位于加州灰霉菌（）分支，M-4 位于盖姆斯木霉（）分支，Q-1 位于圆形镰刀菌（）分支，Q-2 位于枝孢梭菌（）分支，对比序列的同源性均达97%以上。结合形态学鉴定结果，可判定此次分离得到的猕猴桃病原真菌为壳囊孢属（sp.）、波兰青霉（）、加州灰霉菌（）和盖姆斯木霉（），青菜病原真菌为圆形镰刀菌（）、枝孢梭菌（）和加州灰霉菌（）。

图5 7 株病原真菌基于ITS 序列的构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of seven pathogenic fungi based on ITS

2.4 病原真菌生物学特性研究

2.4.1 温度对病原真菌生长的影响 不同温度对7 株病原真菌的生长影响有显著性差异（＜0.05）。M-1 在10～28 ℃范围内可以生长，其余6 株菌在4～30 ℃范围内均可以生长。并且除M-1 外，其余6 株菌的最适生长温度均为20～28 ℃。一般冰箱的冷藏温度为4 ℃，若蔬果本身带有病原真菌，冰箱冷藏的温度并不能防止这些病原真菌侵染蔬果，放入冰箱的冷藏室并不能让蔬果长久保鲜，只可能减缓病原真菌侵染的速度（图6）。

图6 不同温度对病原真菌生长的影响Fig.6 Effects of different temperatures on the growth of pathogenic fungi

2.4.2 pH 对病原菌真菌落生长的影响 不同pH 对7 株病原真菌的生长影响有显著性差异（＜0.05）。除Q-2 外，其余6 株菌株的最适pH 在6～8 之间。Q-2 的耐酸性较好，其最适pH 可能在4 以下。Q-1的耐碱性最好，在pH 为10 的情况下，菌落生长的直径平均值为5.5 cm。（图7）

图7 不同pH 对病原真菌生长的影响Fig.7 Effects of different pH treatments on the growth of pathogenic fungi

3 结论

本研究对从发病猕猴桃和发病青菜中分离纯化得到的菌株进行致病性鉴定，发现这7 株真菌均能够对应地引起猕猴桃和青菜腐烂。通过形态学结合ITS 鉴定，确定从发病猕猴桃分离出的4 株病原真菌为壳囊孢属sp.、波兰青霉、加州灰霉菌和盖姆斯木霉，确定从发病青菜分离出的3 株病原真菌为圆形镰刀菌、枝孢梭菌和加州灰霉菌。加州灰霉菌可以同时引起猕猴桃和青菜腐烂，灰霉菌是常见的植物病原真菌，对于多种果蔬均有危害。在蔬果储运过程中，这类致病菌可以引起大规模的腐烂，甚至会导致多种蔬菜水果同时腐烂，对其防治应该更加重视。本研究测定了7 株病原真菌的最适宜的温度和pH，为猕猴桃和青菜腐病发生规律和防治研究奠定了较好的基础。研究结果表明20～28 ℃，pH 为6～8 的条件有利于猕猴桃和青菜的大部分病原真菌生长。研究还发现枝孢梭菌的耐酸性较强，最适生长pH 可能在4 以下。波兰青霉、加州灰霉菌、盖姆斯木霉和枝孢梭菌在4 ℃的情况下均可以生长，并且加州灰霉菌和盖姆斯木霉生长较快，说明冰箱冷藏的温度并不能防止这些病原菌侵染蔬果。

综上所述，本研究对猕猴桃和青菜腐病病原真菌进行分离纯化、致病性鉴定、种属鉴定及生物学特性的测定。确定了猕猴桃和青菜的病原真菌的种类和其生物学特性，本文研究结果为猕猴桃及青菜病原菌的防治提供参考依据。