基于电子鼻和SPME/GC-MS 技术对勐海县晒青茶的挥发性物质分析

刘学艳，黄飞燕，周启武,

（1.滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南临沧 677000；2.云南省红茶工程技术研究中心，云南临沧 677000）

晒青茶是国家地理标志产品普洱茶的唯一原料，由云南大叶种茶树鲜叶经杀青-揉捻-干燥等加工而成。优质晒青茶条索完整、色泽调和均匀；茶汤绿黄明亮、香气馥郁持久带花果香，滋味醇厚回甘；氨基酸、茶多酚等内含成分丰富，既是晒青茶调节代谢性疾病等保健功能的基础，也是高品质普洱茶香气和滋味的物质基础。随着消费者对天然、本味、绿色食品的重视程度逐渐提高，晒青茶的品质已成为关注重点。学者也对晒青茶进行过大量研究，包括晒青茶的加工工艺、灭菌方法、农药残留等。

挥发性物质是茶叶在加工过程中通过氨基酸类、苯丙烷类、多酚类等代谢途径产生的次生代谢产物，作为衡量茶叶香气的重要因素，既是茶叶呈香的主体物质，也是茶叶生物活性的物质基础。茶汤的茶香主要是由不同浓度的不同种芳香物质组合呈现，由大量带芳香气味的组分赋予了茶叶独特的香气。红茶、白茶、绿茶、普洱茶、乌龙茶的挥发性物质研究取得重大进展，主要的十大挥发性物质已经明确。但作为普洱茶原料的晒青茶挥发性物质研究较少。研究晒青茶挥发性物质可以确定香气种类及含量、发现优势香气物质及“日晒味”香气骨架，从而辅助判断香型、区别茶类；也为探究晒青茶的呈香机理、开发高香晒青茶提供理论依据。因此，研究晒青茶挥发性物质具有重要意义。

近年来，研究挥发性香气物质的仪器主要有电子鼻、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）以及气相离子迁移谱仪（GC-IMS）；其中，电子鼻方便携带，检测速度最快，可以根据挥发性物质对样品进行快速的聚类分析；气相色谱-质谱联用仪灵敏度高，且与固相微萃取技术（SPME）联合使用时，样品前处理简单，有机溶剂消耗少。SPME 与GC-MS 联合可以对挥发性物质进行分离、鉴定，目前广泛用于食品、茶叶等挥发性物质的分析检测。如赵苗苗等将电子鼻和GC-MS 联合测定临沧市的晒青茶挥发性物质，认为两者结合能够相对全面地了解晒青茶挥发性物质；也有学者将电子鼻、HS-SPME-GC-MS、HS-GC-IMS 联合使用，全面分析食品风味物质。据文献报道，晒青茶的挥发性香气物质主要包括醇类、醛类、酮类、烃类等。产地、树龄、加工工艺（杀青方法、揉捻方法、干燥技术）等都会影响晒青茶挥发性物质；马超龙研究发现，晒青茶加工过程中，醇类挥发性物质含量差异最大，尤其是揉捻叶中醇类物质占挥发性物质总含量的82.25%；戴兵等的研究指出，高压脉冲电场处理可以提高晒青茶的醇类香气物质。

西双版纳勐海县是优质晒青茶的核心产地之一，大量的优质晒青茶产自格朗和乡、南糯山乡、西定乡、勐宋乡等。前人研究表明，勐海县的晒青茶在水浸出物、茶多酚、儿茶素等内含成分上比勐腊县、双江县的晒青茶丰富；在感官品质较临沧市云县、凤庆县等地的晒青茶更优，但关于勐海县晒青茶挥发性物质的研究较少。综上，本试验采用电子鼻和SPME/GC-MS 联用技术，对勐海县8 份晒青茶样品进行挥发性物质检测和分析，旨在深入了解勐海县晒青毛茶香气的挥发性物质组分及含量，为探索西双版纳地区茶叶的“勐海味”奠定基础，也为勐海县晒青毛茶的拼配提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验供试材料来自于云南省西双版纳州勐海县，于2017 年4 月按照一芽三叶的标准采摘勐海大叶种茶树鲜叶，按照相同标准制成晒青毛茶（表1），密封保存在同样的环境条件下，于同年7 月使用电子鼻和气质联用仪进行挥发性物质检测。

表1 勐海县晒青毛茶样品信息Table 1 Sun-dried green tea samples informations of Menghai County

PEN3 便携式电子鼻 德国Airsens 公司；HP78-90A-5975C GC-MS 气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 公司；A13204-N 电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司；DHG-9140 型电热鼓风干燥箱 上海中友仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 电子鼻分析

1.2.1.1 电子鼻检测条件 采用德国Airsens 公司PEN3 便携式电子鼻（Portable Electronic Nose）进行检测，样品准备时间为5 s；进样流量为300 mL/min；清洗通道200 s，平衡45 s，测定时间为60 s，取响应信号区间55～57 s 进行数据分析，具体传感器性能描述见表2。

表2 电子鼻传感器名称与性能描述Table 2 Electronic nose sensor name and performance description

1.2.1.2 香气采集方法 采用干茶法（称取3 g 茶样置入150 mL 锥形瓶中，用保鲜膜密封静置30 min，将电子鼻香气探测头伸入锥形瓶中收集香气数据）；茶汤法（取下保鲜膜，往锥形瓶中注入150 mL 沸腾的超纯水，再用保鲜膜将瓶口密封，待茶汤冷却45 min 至室温后，采集茶汤香气数据）；叶底法（将茶汤倾倒完全，再用保鲜膜将瓶口密封，待30 min 后进行叶底香气采集）三种方法采集茶样挥发性物质，每个茶样平行测定3 次，再用电子鼻配套软件Win-Muster，对数据进行LOD 和LDA 分析。

1.2.2 GC-MS 分析方法

1.2.2.1 香气萃取方法（SPME）将茶样置于干燥器内，实验前准确称取10.0 g 茶样放入自制的顶空萃取瓶中，立即加入30 mL 100 ℃的高纯水，加盖密封后置于55 ℃水浴，6 min 后插入预先老化过的65 μm PDMS/DVB 萃取头进行萃取，吸附时间45 min，取出后立即插入色谱进样口中解吸附5 min，完成香气采集。

1.2.2.2 GC 条件 采用HP-5MS 毛细管色谱柱（柱长30 m、内径0.25 mm、液膜厚度0.25 μm）；载气为氦气（He），纯度＞99.999%，流速1.0 mL/min；进样口温度为250 ℃，ECD 检测器温度250 ℃，起始柱温为50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至250 ℃，分流进样，分流比30:1。

1.2.2.3 MS 条件 离子源为EI，气质接口温度为280 ℃，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电子倍增器电压为1894 V。

1.2.2.4 定性和定量方法 根据气相色谱/质谱联用（GC-MS）分析得到挥发性成分的总离子色谱图，通过计算机检索，参考标准谱图（NIST08 和NIST08s），同时结合相对保留时间，查阅茶叶香气文献资料及数据，对样品挥发性成分进行定性，确认各峰化合物名称；并用峰面积归一化法分析各香气组分相对含量，面积计算采用岛津CR-2AX 色谱数据处理。

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2010 对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻检测结果分析

通过电子鼻仪器采集了8 个晒青茶的挥发性香气物质信息后，对数据进行LDA 和LOD 分析。其中，LDA 分析法可以看出不同的香气采集方法下，构成晒青茶挥发性物质的化合物种类，以及不同的化合物对香气物质的贡献率的高低。而LOD 分析可以看出不同样品的挥发性物质的总体差异，对样品进行聚类分析。

2.1.1 LOD 分析 8 个晒青茶挥发性物质信息的LOD 分析结果如图1 所示。在Correlation-M 矩阵下，干茶法（图1A）、茶汤法（图1B）、叶底法（图1C）的Linear Discriminant1 和 Linear Discriminant2 的贡献率之和分别达到98.86%、98.64%、97.87%，能够代表晒青茶样品的挥发性物质信息。干茶法中，传感器W1W 对第一主成分的贡献率最大，传感器W2S 对第二主成分的贡献率最大，W1S 和W3S 次之。说明硫化物类、烃类、甲基类化合物对干茶香气贡献率较高。茶汤法中，传感器W1W 对第一主成分的贡献率最大，其次是W3S 和W5S；传感器W3S对第二主成分的贡献率最大，说明硫化物类、烃类（长链烷烃）、氮氧化合物类是茶汤的主要挥发性香气物质；叶底法中，传感器W1W 对第一主成分的贡献率最大，其次是W2W；传感器W3S 对第二主成分的贡献率最大，其次是W5S 和W2S，说明硫化物类、芳香烃类、长链烷烃、氮氧化合物类、醇、醛、酮类对叶底的香气贡献率较高。综合上述3 种香气采集方法，可以看出硫化物类、烃类对晒青茶挥发性香气贡献率较高，其次是氮氧化合物、长链烷烃以及醇醛酮类；同时可以看出，干茶、茶汤、叶底的主要挥发性物质存在一定的差异。

图1 电子鼻检测结果LOD 分析Fig.1 LOD analysis of electronic nose detection results

2.1.2 LDA 分析 8 个晒青茶挥发性物质信息的LDA 分析结果如图2 所示。在Corre-lation-M 矩阵下，干茶法（图2A）、茶汤法（图2B）、叶底法（图2C）的Linear Discriminant1 和 Linear Discriminant2 的贡献率之和分别达到82.25%、87.74%、94.26%，能够代表晒青茶样品的挥发性物质信息，且LDA 分析法可以将不同产地的晒青茶样区分开来。由图2 可知，茶汤法和叶底法将8 个茶样分为4 组，其中NN、XD、BL、GL、ZJ 挥发性物质信息图谱分布在相近区域，说明南糯山茶样（NN）、西定茶样（XD）、布朗山茶样（BL）、格朗和茶样（GL）、章家三队茶样（ZJ）的挥发性物质在种类和含量上都比较接近；BD、BJ、ZL 茶样分别分布在三个区域，与其余5 个样品距离较远，说明巴达茶样（BD）、布朗山边境茶样（BJ）、巴达章朗茶样（ZL）的挥发性物质信息差异较大。但在干茶法中，GL 茶样与NN、XD、BL、ZJ 茶样的挥发性物质信息图谱没有分布在邻近区域，说明干茶法与茶汤法、叶底法富集到的挥发性物质存在一定的差异。

图2 电子鼻检测结果LDA 分析Fig.2 LDA analysis of electronic nose detection results

2.2 GC-MS 检测结果分析

通过SPME-GC-MS 仪器，8 个晒青茶样品中共检测到55 种挥发性香气物质，包括醇类（9 种）、醛类（9 种）、酮类（6 种）、酯类（7 种）、杂环类（4 种）、氮氧化合物类（1 种）、烯烃类（13 种）、烷烃类（5 种）、芳香烃类（1 种）。8 个茶样中的挥发性香气物质种类和相对含量见表3。

由表3 可知，8 个晒青毛茶样品的挥发性物质种类基本一致，以醇类、醛类、酯类、酮类、杂环类、烷烃类、烯烃类为主；其中，反-2-辛烯醛、苯乙醛、藏花醛、-松油醇、芳樟醇及其氧化物、香叶醇、（+）-柠檬烯、v-依兰油烯、-依兰油烯、2,2,6-三甲基环己酮、-紫罗兰酮、植酮、香叶基丙酮、领苯二甲酸二丁酯、亚麻酸甲酯、二氢猕猴桃内酯、二十烷等是8 个晒青茶样品中共有的挥发性物质。不同茶样中的挥发性物质在含量上有较大差异，尤其是醇类物质。ZL茶样中的醇类物质含量最高，主要是芳樟醇（31.61%）、脱氢芳樟醇（3.58%）、-松油醇（10.04）、香叶醇（8.69%）和植物醇（9.96）含量较高；BJ 茶样中的醇类挥发性物质含量最低，仅为37.14%，芳樟醇含量仅为21.76%，但BJ 茶样中的v-依兰油烯（1.01%）、-紫罗兰酮（0.23%）、吲哚（0.83%）和二十九烷（1.44%）这几种物质含量明显高于其它7 份茶样。除醇类物质外，ZL 茶样中的罗勒烯（1.11%）、-紫罗兰酮（1.89%）、植酮（1.13%）和香叶基丙酮（0.52%）含量也高于其它7 份茶样；BD 茶样中的-依兰油烯（1.38%）、反式芳樟醇氧化物（4.04%）、亚麻酸甲酯（0.72%）、二十四烷（0.13%）这几种含量均高于其它7 组茶样。BD 茶样特有的香气成分为二十四烷（0.13%）；XD 特有的香气成分为联苯烯（0.11%）；ZJ 茶样特有的香气成分为糠醇（0.90%）；GL 茶样特有的香气成分为2-莰烯（0.38%）。正是这些不同种类和含量的香气物质，以及特有的香气成分为各地区晒青茶的独特品质奠定了基础。

表3 8 个晒青茶样品的挥发性物质种类及相对含量（%）Table 3 Types and relative contents of volatile compounds in 8 sun-dried green tea samples (%)

为比较勐海县不同产地的8 份晒青茶样品各类香气物质种类总数和相对含量的差异，根据表3，将各类香气物质的种类及相对含量统计如表4。

由表4 可以看出，8 个茶样的挥发性物质种类总数差异不大，总相对含量差异较大。其中，ZL 茶样（87.45%）、GL 茶样（87.27%）和ZJ 茶样（82.15%）的挥发性物质相对总含量均高于80%，而BJ 茶样（64.36%）、BL 茶样（67.66%）和BD 茶样（63.50%）均低于70%。从物质种类来说，醇类、烯烃类、酯类、烷烃类、氮氧化合物类相对含量差异较大。其中，醇类占所有挥发性物质的比例最高且差异最大，最高为ZL 茶样（64.02%），最低为BJ 茶样（37.14%），即醇类是造成BJ 茶样和ZL 茶样挥发性物质总相对含量差异较大的重要原因。除醇类物质外，烯烃类和烷烃类物质在8 个茶样中的相对含量差异也比较大。其中，来自于西定乡的三个茶样烯烃类物质相对含量分别为：BD（6.09%）、ZL（7.11%）、XD（6.66%），其均值（6.62%）高于产自格朗和乡（5.08%）和布朗山乡（4.20%）的茶样，即西定乡晒青茶样的烯烃类挥发性物质相对含量较格朗和乡和布朗山乡的晒青茶样高。醇类、烯烃类、酮类是ZL 茶样的优势香气物质，烷烃类、酯类、杂环类、氮氧化合物类分别是BJ 茶样、BL 茶样、NN茶样、ZJ 茶样的优势香气物质。正是这些不同种类及不同含量的挥发性物质构成了各个产地晒青茶的独特香气特征。

表4 8 份晒青茶样品各类香气物质种类总数和相对含量Table 4 Total number and relative content of aroma components in 8 sun-dried green tea samples

3 讨论与结论

由电子鼻LDA 分析表明，电子鼻可以根据晒青茶挥发性物质对不同产地的茶样进行简单的聚类分析，并将差异明显的茶样筛选出来，也可以看出构成挥发性香气物质的化合物类别，但无法知道各类化合物的具体组成物质及其含量。GC-MS 检测刚好可以弥补电子鼻的不足。由电子鼻LOD 分析结果可知，硫化物类、烃类对晒青茶香气贡献率最高，其次为长链烷烃类、氮氧化合物类、醇类、醛类、酮类等。其中，醇类、醛类、酮类物质在GC-MS 结果中也是主要的香气物质，但硫化物在GC-MS 结果中并非优势香气物质，可能有两个原因：一是电子鼻与GC-MS 数据库系统对物质分类的方法不一致；二是电子鼻对硫化物的灵敏度很高（1 mL/m），且有两个传感器（W1W、W2W）可以识别有机硫化物；但赵苗苗等认为可能是因为香气采集时，对锥形瓶进行密封的塑料薄膜中含有硫化物。据陈娇娇研究报道：HS-SPME 萃取方法存在香气竞争，不能完全富集C以下的小分子成分，或富集到的部分香气物质与计算机谱库数据匹配度较差，因此检出的挥发性物质含量与茶样实际含量存在一定的差异。

由GC-MS 结果可知，勐海县8 个晒青茶样的9 大类挥发性物质中，烯烃类物质种类最丰富，醇类物质相对含量最高且差异最大。据宁静等等的研究结果可知，醇类是茶叶呈花果香的主要物质，芳樟醇具有花木香，香叶醇具有玫瑰花香，-松油醇具有丁香味，这3 种醇类也是8 个晒青茶中共有的成分。本次检测中，植物醇在晒青茶样中含量差异很大，仅有ZL、XD、ZJ、GL 四个茶样中含有植物醇，分别为9.96%、11.32%、22.16%、16.71%，其余茶样中均未检测出来。据马超龙研究显示，植物醇仅存在于晒青茶的在制品（鲜叶、杀青叶、揉捻叶）及日晒3 h 的样品中，成品茶样中无植物醇；结合坤吉瑞等的研究表明，可能是因为本次实验中在对晒青茶进行日光干燥时，仅保证了光照时间一致，而光照强度不完全一致。综上，植物醇是构成8 种茶样挥发性物质含量差异的主要原因之一，但并非是晒青茶的标志性挥发性物质。

从产地来看，格朗和乡的茶样（NN、GL）优势香气物质为醛类，西定乡的茶样（BD、ZL、XD）优势香气物质为烯烃类，布朗山乡茶样（BJ、BL、ZJ）的优势香气物质为酮类和烷烃类。三个产区的晒青茶挥发性物质相对含量均值分别为：格朗和乡82.475%、西定乡73.97%、布朗山乡71.39%，可以看出格朗和乡的晒青茶挥发性物质相对含量较西定乡和布朗山乡高，说明在茶树品种和加工工艺相对一致的条件下，产地对晒青茶挥发性物质有重要影响，这主要是因为各个产地茶树的生长环境不一致，包括光照强度、光照时间、温湿度等。

综上所述，电子鼻可以看出晒青茶样挥发性香气物质整体差异以及主要的香气物质类别，硫化物及烃类是电子鼻富集到的晒青茶主要挥发性物质；电子鼻也能对晒青茶进行简单的聚类分析，将8 组茶样大致分为4 组，NN、XD、BL、GL、ZJ 茶样为一组，而BD、BJ、ZL 分别为一组。GC-MS 可以检测出茶样的挥发性物质种类及相对含量。8 个晒青茶样品中共检测出55 种挥发性物质，主要是醇类（9 种）、醛类（9 种）、酮类（6 种）、烯烃类（13 种）、杂环类（4 种）、酯类（7 种）、烷烃类（5 种）、氮氧化合物类（1 种）、芳香烃类（1 种）。其中，醇类对晒青茶挥发性物质相对含量的影响最大。8 个晒青茶样中共有的挥发性物质有19 种，含量较高的10 种挥发性物质分别是3 种醇（芳樟醇、-松油醇、香叶醇）、2 种醛（苯乙醛、藏花醛）、2 种酮（-紫罗兰酮、植酮）、2 种杂环类（顺式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物）、1 种酯（二氢猕猴桃内酯）。格朗和乡的晒青茶挥发性物质总相对含量高于南糯山乡和西定乡，主要表现在醛类物质上。布朗山乡的晒青茶优势香气物质为酮类和烷烃类，西定乡的优势香气物质为烯烃类，即不同产地的晒青茶具有不同的优势挥发性物质，正是这些不同种类及不同含量的挥发性物质共同形成了勐海县晒青茶一山一味的特点。