气相色谱-四极杆/飞行时间质谱法非靶向快速筛查葡萄中农药多残留

丰东升 王 霞 李雪颖 马颖清 王 敏 方丝芸 韩奕奕 张维谊

（上海市农产品质量安全中心，上海 201708）

葡萄是我国重要的果树树种之一。我国是目前全球第二大葡萄生产国，是第一大鲜食葡萄生产国。据国家统计局数据，2020年，我国葡萄产量为1 431万t，同比增长0.8%[1～2]。然而葡萄从新芽萌发到果实采收阶段的病虫害防治一直是一个难题，其主要的病虫害有霜霉病、白粉病、灰霉病、炭疽病、白腐病、枝干病害等。通过对中国农药信息网的农药登记数据统计，截至2022年7月1日，我国葡萄生产上登记的农药产品共832种，包括杀菌剂、杀虫剂和植物生长调节剂等[3～5]。因此，建立葡萄中农药残留的非靶向快速筛查分析方法十分必要。高分辨质谱是目前用来筛查食品基质中污染物的主流分析手段[6～10]。高分辨率气相色谱－四极杆/飞行时间质谱（GC－Q－TOF/MS）[11～17]系统的一项优势是能够在一次运行中筛查几乎无限多的化合物，且灵敏度不受影响。本研究对GC－Q－TOF/MS在定性筛查过程中影响相对较大的仪器运行、筛查、定量等条件进行优化确定，以葡萄为研究对象，探讨建立75种农药的高通量筛查方法。

一、材料与方法

（一）仪器Agilent 7890B气相色谱－7200B四极杆/飞行时间质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Milli－Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

（二）试剂和材料乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；水为超纯水；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠（分析纯，德国Merck公司）；75种农药混合标准溶液（浓度为100 μg/mL，质量分数≥95%，天津阿尔塔科技有限公司），于－18℃冷冻避光保存备用；一步法快速前处理小柱（SHIMSEN QPet－GE+，日本岛津公司）；0.22 μm有机相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；葡萄样品购自上海农贸市场。

（三）样品前处理方法

1.提取。准确称取葡萄样品10 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，准确加入乙腈20 mL，高速涡旋混匀，超声20 min。然后加入硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g，盖上盖子，剧烈振摇约30 s，以100 kHz超声30 min，完毕后取出，以8 000 r/min离心5 min。

2.净化。用SHIMSEN QPet－GE+一步法快速前处理小柱处理后，取离心后上清液3 mL过0.22 μm有机相滤膜，待测。

（四）基质标准溶液配制将本底中不含有目标化合物的空白葡萄样品按照前处理方法制得空白基质溶液。将10 μg/mL 75种农药混合标准工作液用空白基质溶液进行稀释，得到质量浓度为0.04、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的系列基质标准溶液，现配现用。

（五）仪器运行条件

1.气相色谱条件。色谱柱为5%－苯基－甲基聚硅氧烷毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升温程序为60℃保持1 min后以40℃/min升温至120℃，再以5℃/min升温至310℃。载气为氦气（纯度≥99.999%），流速为0.717 mL/min；进样口温度为280℃；进样量为2.0 μL；进样方式为脉冲不分流。

2.质谱条件。电离源为电子轰击源，能量为70 eV；离子源温度为280℃；传输线温度为280℃；溶剂延迟时间为4 min；离子监测模式为全扫描模式；扫描范围为50～500m/z；扫描速率为5 Hz。

二、结果与分析

（一）提取剂的比较本研究采用添加回收方式，分别考察了丙酮和乙腈作为提取剂对目标化合物的提取效果。结果表明，加标水平为0.30 mg/kg时，乙腈作为提取剂，目标化合物的回收率优于丙酮。这主要是由于葡萄含水量较高，丙酮更易发生乳化反应，且更易提取色素；采用乙腈提取时，加入的无水硫酸镁、氯化钠等无机盐能够很好地起到盐析作用，液液分离效果好。

（二）仪器运行条件的选择

1.气相色谱升温程序的选择。本研究考察了两种升温程序（见表1和表2）运行0.05 μg/mL 75种农药混合标准溶液的分析结果。发现运行相同农药混合标准溶液，采用表1的升温程序时，含有同分异构体的农药化合物色谱峰重叠，且峰型不好；采用表2的升温程序时，农药化合物色谱峰之间完全分离，分离效果优于前者。因此，本研究确定采用表2的升温程序。

表1 总运行时间为20.75 min的升温程序

表2 总运行时间为40.5 min的升温程序

2.质谱采集条件的选择。本研究考察了2 GHz低分辨率和4 GHz高分辨率两种采集模式运行0.05 μg/mL 75种农药混合标准溶液的分析结果，两种模式下的总离子流图分别见图1和图2。发现运行相同农药混合标准溶液，4 GHz高分辨率采集模式精确度高，但运行高浓度标准溶液的质谱图易饱和，且灵敏度低于2 GHz低分辨率采集模式。因此，本研究确定采用2 GHz低分辨率采集模式。

图1 2 GHz模式下的总离子流图

图2 4 GHz模式下的总离子流图

（三）筛查条件的优化筛查方法需要经过优化以减少假阳性和假阴性结果的数量，可优化的参数包括保留时间（RT）窗口、质量数准确度、提取离子流色谱图（EIC）共流出得分和谱库匹配得分等。一般情况下将质量数准确度设定为5 mg/kg，将RT窗口设定为0.1 min。RT锁定与反吹可提供良好的RT精密度和重现性，有助于减少假阳性结果。谱库匹配得分根据实际样品情况进行调节设定，能更好地消除假阳性和假阴性结果。

本研究使用目标疑似物筛查工作流程和农药化合物数据库，结合保留时间差值（ΔRT）、EIC共流出得分和质量数准确度，对复杂食品基质中的农药化合物进行疑似筛查。每种农药化合物自动提取最多7个离子，要求其中至少两个离子满足信噪比≥3及EIC共流出得分≥50的条件。若保留时间差值在±0.15 min范围内的化合物符合上述要求，则视为得到鉴定。本研究将EIC共流出得分由≥70降低至≥50，增加了匹配不易打碎化合物的概率。设置EIC峰过滤器，将绝对峰高≥50提升至≥1 000，以排除基质杂峰。在此模式下筛查0.05 μg/mL 75种农药混合标准溶液，结果显示农药化合物可全部检出，主要判断依据见表3。

（四）定量条件的建立本研究根据75种农药混合标准溶液建立定量处理方法，对样品中筛查出的农药进行准确定量。配制0.05、0.1、0.5 μg/mL的75种农药混合标准溶液，结合NIST数据库和PCDL数据库提供的化合物特征离子，从标准溶液质谱图中挑选出4个合适的特征离子，特征离子1作为定量离子，特征离子2、3、4作为定性离子（见表3）。

表3 75种农药化合物筛查结果及定量条件

（五）方法学考察

1.标准工作曲线和线性范围。利用上述优化好的条件，取不同质量浓度的基质标准溶液进行气相色谱－四极杆/飞行时间质谱检测，以农药化合物的峰面积（y）为纵坐标，对应的质量浓度（x）为横坐标作图，获得标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数（R2），结果见表4。由结果可知，在0.04～2.00 μg/mL的质量浓度范围内，75种农药化合物线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.99。

续表3

表4 75种农药化合物在葡萄基质中的线性回归方程、相关系数、回收率和相对标准偏差（RSD）

续表4

2.回收率和精密度。利用上文确定的样品前处理和仪器条件，称取空白葡萄样品后分别加入混合标准溶液，以0.3、0.6、1.5 mg/kg 3个浓度水平进行加标回收实验，每个添加水平均做6次平行测定，结果见表4。结果显示，75种农药化合物的回收率为60.9%～104.4%，相对标准偏差（RSD）为0.2%～26.3%。

3.检出限和定量限。依据GB/T 27417－2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[18]中信噪比（S/N）法确定方法检出限（LOD）和定量限（LOQ），以S/N＝3计算方法LOD，以3倍LOD作为方法LOQ。经计算，最终确定75种农药目标化合物的检出限为0.08 mg/kg，定量限为0.24 mg/kg。

（六）实际样品的检测采用建立的方法对市售的210批次葡萄样品进行检测，检出农药残留为腐霉利、氟唑菌酰胺，其余未检出。其中，4批次葡萄样品检出腐霉利，检出率为1.9%，残留值在0.24～0.43 mg/kg范围内；2批次葡萄样品检出氟唑菌酰胺，检出率为1.0%，残留值在0.32～0.58 mg/kg范围内，农药残留检测结果均符合GB 2763－2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[19]的限量要求。同时，在空白基质中添加目标化合物进行盲样测试，回收率＞60%，检测结果符合方法学要求，说明该方法适用于葡萄中农药多残留非靶向快速筛查。

三、结论

本文建立了基于GC－Q－TOF/MS的葡萄中农药多残留非靶向快速筛查方法，通过优化筛选条件，确定了定性筛查数据处理的最佳参数，降低了筛查出现假阳性和假阴性结果的概率。该方法快捷有效、灵敏度高、重现性好，可用于葡萄中农药多残留快速筛查与测定。同时从方法本身来说，有一定的拓展性，针对数据库的后续扩展能够覆盖更多化合物以及面向更多种类基质。