气相色谱-三重四极杆质谱结合程序升温-大体积进样测定果蔬中53种农药残留

周 蓉 赵肖华 杨 欢 吴 俐 曹赵云

（中国水稻研究所，农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心，杭州 311401）

我国是农药生产和使用大国，农药的使用为农产品增产和农民增收起到重要保障作用，但与此同时也给人类健康、生态环境等造成威胁[1～2]。近年来，我国农药残留检测技术发展极为迅速，如今已逐渐形成了以质谱技术为主的检测方法标准[3～4]。其中，气相色谱－串联质谱联用（GC－MS/MS）技术是测定有机磷、有机氯、菊酯类等农药残留的最为有效的手段之一，其与液相色谱－串联质谱联用技术形成优势互补，构成当前农药残留检测的两大技术体系[5～7]。然而，GC－MS/MS也存在一些较为明显的技术缺陷。首先，最为常用的电子轰击（EI）电离模式，会导致部分菊酯类农药（如氯氰菊酯、溴氰菊酯等）灵敏度略显不足。其次，数据质量受基质干扰严重，需频繁对进样口、色谱柱、离子源等进行维护，特别在面对如今以QuECh-ERS为主的样品处理技术时尤为明显，如检测茶叶等基质中乙酰甲胺磷时，在数十次进样后，其灵敏度下降一半以上，色谱峰拖尾情况也随之发生，严重影响定量结果。

程序升温－大体积进样是提高GC－MS/MS分析灵敏度的重要手段[8～9]。首先样品被注入低温进样口，在气体吹扫下大量溶剂被排出系统，随后的瞬时高温再将汽化目标物引入色谱分离系统。这种进样方式可允许更大的进样体积，使得分析灵敏度显著提高，伴随溶剂效应的大幅降低，低沸点化合物的重现性也将得到明显改善。目前大体积进样技术主要应用在水质、空气检测领域[10～11]，针对复杂农产品基质的检测应用较少。QuEChERS样品处理技术因操作简便、通量高等优点被日益广泛应用，但其净化能力有限，需要附加更多的净化材料或净化步骤才能更好地运用到GC－MS/MS分析中，如GB 23200.113－2018标准方法中就额外增加了溶剂转换步骤，以增强基质净化能力。因此，在开发适合于大体积进样的GC－MS/MS方法时，提高样品净化能力是关键。

本研究基于QuEChERS技术，通过在分散萃取剂中加入石墨化碳黑（GCB）以及加入甲苯进行二次净化，建立了我国农产品监测频次较高的53种农药残留（包括有机磷、有机氯和菊酯类）的大体积进样GC－MS/MS检测方法。该方法有效解决了现有GC－MS/MS技术灵敏度低、耐受性差的问题，且方法操作简便、快速，结果稳定可靠。

一、材料与方法

（一）仪器与试剂Agilent 7890A－7000A气相色谱－三重四极杆质谱联用仪，配有多模式进样装置（G3510A），配有EI源（美国Aglient公司）；高速分散机（德国IKA公司）；旋涡振荡仪（德国IKA公司）；台式高速离心机（美国Thermo Fisher公司）。

乙腈、丙酮和正己烷（色谱纯，美国Tedia公司）；甲苯 （农残级，美国Tedia公司）；硫酸镁（纯度＞97%，比利时ACROS公司）；氯化钠（农残级，德国CNW公司）；QuEChERS净化剂由无水硫酸镁（MgSO4）、GCB、弗罗里硅土、乙二胺－N－丙基硅烷化硅胶（PSA）和十八烷基键合硅胶（C18）组成，均购于美国Thermo Fisher公司。标准品：质量浓度为100 mg/L的53种农药混合标准溶液（天津阿尔塔科技有限公司）。9种固体内标物：D3－乙酰甲胺磷、13C6－γ－六六六、D6－甲基对硫磷、13C4，15N2－氟虫腈、D5－异菌脲、D6－苯醚甲环唑、D5－甲氰菊酯、D10－毒死蜱和D5－氰戊菊酯（纯度≥98%，美国Sigma公司）。实验用水为Milli－Q高纯水。

（二）实验方法

1.样品前处理。称取10.0 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈，在高速分散机中高速匀浆2 min，加入4.0 g无水MgSO4和1.0 g氯化钠，匀浆1 min，以4 200 r/min离心3 min，使乙腈和水相分层。移取上层乙腈相1.5 mL于15 mL刻度离心管中（预先加入40 mg PSA、40 mg C18、40 mg GCB和0.5 g无水MgSO4），加 入0.5 mL甲苯溶液。涡旋混合1 min后，以8 000 r/min离心5 min。取上清液1.0 mL，加入5 mg/L内标混合物20 μL，混匀待测。

2.色谱－质谱条件。（1）多模式进样口条件：进样口初始温度为50℃；进样量为3 μL；程序升温进样口（PTV）的温度程序设置为50℃保持0.2 min，以720℃/min升温至300℃保持5 min，再以720℃/min降温至50℃；压力为51.7 kPa；吹扫流量为60 mL/min；吹扫时间为2.5 min；放空流速为100 mL/min，放空压力为34.5 kPa，放空时间为0.2 min。（2）气相色谱条件：色谱柱HP－5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；柱箱升温程序为初始温度50℃，以25℃/min升温至280℃保持10 min；后运行条件为300℃，3 min。（3）质谱条件：EI源温度为230℃；传输线温度为280℃：碰撞气流速为2.25 mL/min；猝灭气流速为1.5 mL/min；电子能量为70 eV；四极杆温度为150℃。53种农药及9种内标的质谱参数见表1，总离子流图见图1。

图1 53种农药（0.1 mg/L）和9种同位素内标（0.1 mg/L）标准溶液的总离子流色谱图

表1 53种农药和9种同位素内标的保留时间及特征离子

续表1

二、 结果与讨论

（一）程序升温-大体积进样模式参数的优化本研究对在使用程序升温－大体积进样模式进样时所涉及的主要参数（吹扫流量、吹扫时间、放空流速、放空时间以及进样体积等）进行考察，具体参数设置见上文“色谱－质谱条件”部分。由研究结果可见，进样量大容易使衬管变脏，引起峰拖尾，本研究采用720℃/min的升温条件快速从50℃升温至300℃，使分析物瞬间汽化，减少分解。通过调节吹扫流量和放空流速能够有效去除基质干扰，在灵敏度得到有效提高的同时，还避免了色谱峰拖尾、重复性变差等现象。结果显示，在采集时间8.5～15 min区域，通过调节吹扫流量，能很好地除去一些杂峰的干扰，同时乙酰甲胺磷、六六六等农药的检测灵敏度也得到提高；通过优化放空流速，乙酰甲胺磷、异菌脲等农药色谱峰的拖尾现象得到很好的改善。

在其他色谱－质谱条件相同的情况下，采用大体积进样模式进样3 μL和常规不分流进样1 μL两种进样方式对53种农药进行分析。结果显示，采用大体积进样模式进样时，氟虫腈、p，p′－滴滴涕、o，p′－滴滴涕、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和苯醚甲环唑这7种农药的响应值是常规不分流进样的2.0～2.5倍，剩余46种农药的响应值是常规不分流进样的3.1～4.0倍，可见采用大体积进样模式显著提高了检测灵敏度。

（二）基于QuEChERS技术的二次净化方法建立

1.吸附剂的用量。根据文献[12～13]，乙腈对大多数农药均有较好的溶解度，具有极性大、穿透力强、提取率高等优点，且油脂和色素等杂质在乙腈中的溶解度较小，因此本研究在综合以上情况和参考GB 23200.113标准后，采用乙腈作为提取溶剂。

据有关研究证明[14～15]，复合净化剂比单一净化剂对杂质的净化效果要好。因此，本研究选择无水MgSO4、PSA、C18和GCB混合物作为分散固相萃取吸附剂，以韭菜为试验对象，在其他3种净化材料用量不变的前提下，分别对4种净化材料的添加量进行考察，结果见图2。当无水MgSO4添加量为0.5 g时，能很好地去除提取液中的水分，且农药回收率基本在70%～120%之间。当PSA添加量为40 mg时，农药回收率基本在70%～120%之间，但当添加量达到80 mg时，乙酰甲胺磷、对硫磷、水胺硫磷等有机磷类农药回收率低于65%。如图2所示，当C18添加量为40 mg时，农药的回收率最高；当C18添加量低于或高于40 mg时，回收率较低。当GCB添加量达到40 mg时，提取液颜色接近无色透明，同时农药回收率也在70%～120%之间；当GCB添加量增加为50 mg时，虫螨腈以及氯氰菊酯、溴氰菊酯等菊酯类农药的回收率低于70%。综合考虑，选择0.5 g无水MgSO4+40 mg PSA+40 mg C18+40 mg GCB作为分散固相萃取吸附剂，此条件下净化效果最好，98%以上的农药回收率在70%～120%范围内。

图2 无水MgSO4(A)、PSA(B)、C18(C)和GCB(D)不同添加量对53种农药回收率的影响

2.甲苯的加入对净化效果的影响。在农药残留检测样品前处理过程中，甲苯是固相萃取中常用的洗脱剂[3～4]，不仅可以调节洗脱能力，还能有效去除共提物中的干扰物。本研究利用甲苯此特点将其应用于分散固相萃取法中，将提取液－甲苯（3∶1，体积比）加入分散固相萃取柱中净化，在实现进一步净化样品、去除杂质的同时也省去了溶剂转换这一步骤。本研究考察了甲苯加入与否对净化效果和萃取效率的影响。结果表明，当连续进样10次后，灵敏度急剧下降，乙酰甲胺磷、氟虫腈、异菌脲以及菊酯类等农药几乎没有响应，衬管内壁富集大量杂质。而在加入甲苯后，上述现象得到了很好的改善，第80次进样后各类农药响应强度仅下降10%以内，衬管内壁没有肉眼可见的杂质。故在净化过程中加入甲苯，可使前处理操作过程更简化，同时也达到了显著净化效果，降低了GC系统中进样口和色谱柱的维护频率。

（三）同位素内标校正在GC－MS/MS分析中，为获得更为准确的定量结果，经常会用到同位素内标校正[16～18]，本研究选择9种具有代表性的同位素标记物作为内标。根据53种农药和9种内标物的出峰时间以及化学基团类似的结构特点，对内标物的选择经过多次试验比较，最终确定53种农药所对应的内标物情况见表1。

在低（0.01 mg/kg）、中（0.02 mg/kg）、高（0.10 mg/kg）3个加标浓度水平下，分别比较芹菜、香菇、橙子3种基质有内标和无内标定量下的加标回收率情况。通过比较可知，无内标校正的情况下很多农药 （如水胺硫磷、o，p′－滴滴涕、p，p′－滴滴涕、五氯硝基苯、氟虫腈、异菌脲、菊酯类农药等）在3种基质中的回收率无法满足测试要求，回收率在63%～145%，而采用相应内标则能将回收率校正至70%～120%的合理范围内。因此，本研究采用9种同位素内标物定量法，进一步解决基质效应所产生的影响。

（四）方法学考察

1.线性范围、检出限和定量限。准确配制质量浓度为10～1 000 μg/L的系列混合标准溶液，按优化后的条件进行测定，并以分析物的峰面积（y）对应各农药的含量（x，μg/L）绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数（r2），结果见表2。结果显示，53种农药在10～1 000 μg/L质量浓度范围内均具有良好的线性关系（r2＞0.995）。以信噪比（S/N）＝3确定检出限（LOD），以S/N＝10确定定量限（LOQ），得到本方法中53种农药的LOD为0.1～1.6 μg/kg，LOQ为0.3～5.3 μg/kg，均符合国内相关残留限量要求。

表2 53种农药的线性方程、相关系数、检出限和定量限

续表2

2.回收率与精密度。在西蓝花、辣椒、大葱、香菇和橙子5种不同空白果蔬样品中分别进行3个水平0.01、0.02、0.10 mg/kg的加标回收实验，每个添加水平重复测定6次，回收率和相对标准偏差（RSD）结果见表3。结果显示，53种农药的回收率为80.3%～119.6%，RSD≤12.0%，说明该方法的准确度和精密度良好，可满足上述果蔬中53种农药的检测要求。

表3 53种农药在5种果蔬中的加标回收率及相对标准偏差 （n＝6）

（五）实际样品检测应用所建方法对市售的15种果蔬（大白菜、芹菜、西蓝花、辣椒、萝卜、大葱、丝瓜、生姜、番薯、刀豆、香菇、平菇、苹果、草莓、葡萄）共100个样品进行测定。结果显示，53种农药的整体检出率达11%，其中芹菜和草莓样品中农药的检出率较高，检出频率较高的农药为腐霉利、虫螨腈、氯氟氰菊酯、异菌脲、联苯菊酯、苯醚甲环唑，但均未超过最大残留限量。

续表3

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三、 结论

本研究建立了气相色谱－三重四极杆质谱结合程序升温－大体积进样模式测定果蔬中53种农药残留的分析方法。该方法样品前处理耗时短，基质净化效果显著，在利用气相色谱－三重四极杆质谱结合程序升温－大体积进样作为检测手段后，灵敏度得到显著提高。同时，该方法采用9种同位素内标法定量，进一步消除了果蔬基质效应所产生的影响，降低了背景干扰，提高了分析准确性，为果蔬中农药残留的快速筛查提供了高效的前处理方法和分析检测技术。