参附注射液结合依达拉奉对心肌缺血再灌注损伤治疗效果的影响分析＊

苏天生 卢静 肖章武 王志民

心肌缺血是由于冠状动脉狭窄而心肌供血不足、供氧不足引起。目前临床上针对心肌缺血主要采用溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（PCI）来尽快恢复其血运，缩短缺血的时间，进而挽救患者的生命[1]。但是在再灌注过程中，可导致组织损伤呈进行性加重，即在缺血期间所引起的损伤性变化在再灌注后更为突出[2]。自由基生成在心肌缺血再灌注损伤中具有重要作用，依达拉奉作为一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，用于心肌缺血再灌注中具有良好的保护作用，减少再灌注损伤的发生[3-4]。而在进一步的研究中有学者发现，Wnt/β-联蛋白（β-catenin）信号通路与心肌细胞的凋亡、坏死及氧化应激具有重要的关联[5]。中成药参附注射液以“益气回阳，温通心脉”的治则用于心肌缺血再灌注治疗可有效改善心电图，降低心律失常发生率，抑制心肌细胞凋亡[6]。为此，参附注射液结合依达拉奉是否能进一步增强疗效受到了临床的高度关注。本文将对两种药物单独应用与联合应用于大鼠的效果进行对比分析，以证实两种药物联合应用时的有效性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 动物材料 本次的研究对象为动物材料，50只SPF级的SD大鼠，均为雄性SD大鼠。纳入标准：日龄 ＞56 d；体重在 300～400 g；雄性大鼠。排除标准：患有血管疾病；实验过程中死亡。所有SD大鼠的喂养环境温度为25 ℃，相对湿度为50%。所有SD大鼠在纳入本实验后喂养1周开始进行实验，本研究的实验过程严格遵守相关条例操作。

1.1.2 主要仪器 日本Olympus公司的BX51型光学显微镜，美国Perkin Elmer公司的XElx800型酶标仪，荷兰Philips公司的1E33型超声心动图检查仪，美国Harvard Apparatus公司的ALC-V8S型小动物呼吸机，德国Eppendorf公司的Centrifuge 5424R型低温高速离心机等。

1.1.3 主要试剂 SOD酶联免疫吸附试验试剂盒（上海西格生物有限公司，批号XG-E0829），MDA酶联免疫吸附试验试剂盒（深圳子科生物科技有限公司，批号ZK-R3358），胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号25200056），7-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号CA1410）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组、模型建立与给药 （1）分组：将50只大鼠编号后采取随机数字表法分为五组，每组10只，分别为空白组、对照组、治疗1组、治疗2组、治疗3组。（2）模型建立：通过手术给予对照组与3组治疗组大鼠进行心肌缺血模型的建立。采用浓度为1%的戊巴比妥钠（生产厂家：上海新亚药业有限公司，批准文号：国药准字H31021725，规格：0.1 g）对大鼠进行麻醉，使用剂量为50 mg/kg，采取腹腔注射给药方式。将大鼠以仰卧体位固定在手术台上。对其胸部进行常规消毒后，将该处皮肤与部分肋骨剖开，使得大鼠的心脏显露，将左冠状动脉前降支分离并结扎，直至其左心室前壁的部分心肌组织呈现白色，即成功建立心肌缺血模型大鼠，最后进行切口的缝合。在手术期间，使用小动物呼吸机维持大鼠的呼吸频率在100次/min，维持呼吸比为1∶2，维持潮气量为8 ml。（3）给药：将对照组与3组治疗组的大鼠通过结扎左冠状动脉前降支引起心肌缺血，再灌注前1 min给予治疗1组参附注射液[生产厂家：华润三九（雅安）药业有限公司，批准文号：国药准字Z51020664，规格：10 ml/瓶 ]9 ml/kg，给予治疗 2 组依达拉奉（生产厂家：山东罗欣药业集团股份有限公司，批准文号：国药准字 H20183189，规格：5 ml∶10 mg）10 mg/kg，给予治疗3组参附注射液9 ml/kg联合依达拉奉10 mg/kg，给予对照组生理盐水 10 mg/kg，空白组大鼠不做任何处理（健康大鼠）。

1.2.2 大鼠组织取材 在完成心功能检测后将大鼠处死，取其心脏后进行心室前壁组织与心肌组织的分离。将心室前壁组织浸泡于浓度为4%的多聚甲醛固定液中，共24 h，备用。心室前壁组织用于检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平，心肌组织用于检测氧化应激相关指标。

1.3 观察指标

1.3.1 心功能指标 使用戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，并将大鼠固定于手术台上，采用超声心动图检测其心功能指标，包括左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）。空白组大鼠检测1次心功能指标即可，对照组与3组治疗组的大鼠分别在灌注10、30、60 min各进行1次心功能指标检测。

1.3.2 心肌组织氧化应激指标 采用酶联免疫吸附法检测，分别将酶标仪设定为490、695 nm波长的条件下进行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的检测。采用DCFH-DA荧光探针法检测活性氧（ROS），使用流式细胞仪测得ROS的水平。

1.3.3 心室前壁组织中Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平 采用Western blot法进行检测心室前壁组织中的Wnt1、β-catenin表达水平，通过全自动凝胶成像系统成像后，采取Image J v1.8.0软件分析，取蛋白与内参灰度值的比值作为该蛋白的表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用配对样本t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般资料对比

各组大鼠一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），有可比性，见表1。

表1 各组大鼠一般资料对比（±s）

表1 各组大鼠一般资料对比（±s）

组别 日龄（d） 体重（g）空白组（n=10） 63.00±4.00 331.42±12.63对照组（n=10） 62.00±3.00 330.23±15.81治疗1组（n=10） 63.00±3.00 333.81±15.25治疗2组（n=10） 62.00±4.00 331.75±15.31治疗3组（n=10） 63.00±4.00 330.89±12.46 F值 0.230 0.090 P值 0.922 0.986

2.2 各组心功能指标对比

空白组LVEF与LVFS分别为（61.75±3.36）%与（44.79±2.68）%。对照组及治疗1、2、3组LVEF、LVFS均低于空白组（P＜0.05）；治疗1、2、3组LVEF、LVFS均高于对照组（P＜0.05）；治疗1、2组LVEF、LVFS比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但治疗1、2组LVEF、LVFS均低于治疗3组（P＜0.05），见表2。

表2 各组心功能指标对比[%，（±s）]

表2 各组心功能指标对比[%，（±s）]

注：空白组LVEF与LVFS分别为（61.75±3.36）%与（44.79±2.68）%。*与同时点空白组对比，P＜0.05；#与同时点对照组对比，P＜0.05；△与同时点治疗3组对比，P＜0.05。

组别 灌注 10 min 灌注 30 min 灌注 60 min LVEF LVFS LVEF LVFS LVEF LVFS对照组（n=10） 43.37±2.06* 25.58±1.69* 41.75±2.18* 24.07±1.65* 39.69±2.27* 23.95±1.71*治疗 1 组（n=10） 46.65±1.88*#△ 28.69±1.75*#△ 49.21±1.75*# △ 31.58±1.88*# △ 53.31±2.12*#△ 33.65±1.81*#△治疗 2 组（n=10） 46.79±1.85*#△ 28.75±1.79*#△ 49.63±1.81*# △ 31.69±1.82*# △ 53.88±2.15*#△ 33.83±1.79*#△治疗3组（n=10） 49.26±1.69*# 31.46±2.07*# 53.36±2.07*# 35.46±2.12*# 57.89±2.46*# 40.76±2.07*#

2.3 各组氧化应激指标对比

对照组及治疗1、2、3组SOD均低于空白组，MDA、ROS均高于空白组（P＜0.05）。治疗 1、2、3组SOD均高于对照组（P＜0.05），MDA、ROS均低于对照组（P＜0.05）。治疗1、2组 SOD、MDA、ROS比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；但治疗1、2组SOD均低于治疗3组，MDA、ROS均高于治疗3组（P＜0.05），见表3。

表3 各组氧化应激指标对比（±s）

表3 各组氧化应激指标对比（±s）

*与同时点空白组对比，P＜0.05；#与同时点对照组对比，P＜0.05；△与同时点治疗3组对比，P＜0.05。

组别 SOD（U/mg） MDA（nmol/mg） ROS空白组（n=10） 88.63±3.75 3.92±0.58 44.38±3.07对照组（n=10） 36.85±1.69* 9.79±0.97* 75.66±4.25*治疗 1 组（n=10） 65.57±3.62*#△ 5.42±1.01*#△ 58.63±5.42*#△治疗 2 组（n=10） 65.88±3.56*#△ 5.33±0.97*#△ 57.99±5.38*#△治疗 3组（n=10） 80.42±3.84*# 4.89±0.72*# 50.69±4.86*#

2.4 各组Wnt1、β-catenin表达水平对比

对照组及治疗1、2、3组 Wnt1、β-catenin表达水平均高于空白组（P＜0.05）；治疗1、2、3组Wnt1、β-catenin表达水平均低于对照组（P＜0.05）；治疗1、2组Wnt1、β-catenin表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗1、2组Wnt1、β-catenin表达水平均高于治疗3组（P＜0.05），见表 4。

表4 各组Wnt1、β-catenin表达水平对比（±s）

表4 各组Wnt1、β-catenin表达水平对比（±s）

*与同时点空白组对比，P＜0.05；#与同时点对照组对比，P＜0.05；△与同时点治疗3组对比，P＜0.05。

组别 Wnt1 β-catenin空白组（n=10） 0.91±0.15 1.12±0.16对照组（n=10） 1.88±0.21* 1.68±0.19*治疗 1 组（n=10） 1.29±0.18*#△ 1.47±0.21*#△治疗 2 组（n=10） 1.33±0.19*#△ 1.47±0.19*#△治疗3组（n=10） 1.17±0.16*# 1.29±0.18*#

3 讨论

当发生心肌缺血再灌注损伤时，由于血运已经处于异常状态，心肌细胞线粒体、血管内皮细胞中黄嘌呤氧化酶与中性粒细胞的呼吸爆发及儿茶酚胺氧化等途径造成的大量自由基产生，导致生物膜的结构受到损伤，引起脂质过氧化的发生，大量的细胞内酶被释放出，导致心肌细胞受损[7]。参附注射液与依达拉奉均对心肌缺血再灌注具有保护作用[8-9]，两者联合将可成为心肌缺血再灌注治疗中的心肌保护治疗新方案，以下将对两者的作用效果及作用机制进行分析。

从此次的研究结果可知，随着再灌注时间的延长，对照组LVEF、LVFS逐渐降低，而治疗1、2、3组LVEF、LVFS逐渐升高。表明在再灌注前使用参附注射液和/或依达拉奉均能发挥保护心肌的作用，减少再灌注损伤的发生。但治疗1、2组LVEF、LVFS无显著差异，且两组LVEF、LVFS均低于治疗3组。表明参附注射液与依达拉奉联合应用时比单独用药的效果更为显著，可发挥更强的心肌保护作用，进而心功能得到更显著的改善。氧化应激在心肌缺血引起的损伤过程中具有重要作用[10]。SOD、MDA、ROS是3项评估氧化应激反应的重要指标。SOD属于一种抗氧化金属酶，能够对超氧阴离子自由基产生催化作用，进而歧化生成氧及过氧化氢，是平衡机体氧化与抗氧化过程的重要物质，当SOD水平降低时则反映出机体发生的氧化应激损伤[11]。ROS是化学反应活性自由基，由于其具有高度反应性，当其生成量过高时，将引发氧化应激，造成DNA损伤、蛋白质功能障碍等，进而导致细胞凋亡与坏死[12]。MDA是脂质过氧化物的终产物，其变化水平与ROS的变化水平呈正相关[13]。本次研究中，对照组与治疗1、2、3组SOD均低于空白组，MDA、ROS均高于空白组。由此可看出相比于健康大鼠，心肌缺血大鼠存在明显的氧化应激反应。治疗1、2、3组SOD高于对照组，MDA、ROS均低于对照组。治疗1、2组SOD、MDA、ROS无显著差异，且该两组的SOD均低于治疗3组，MDA、ROS高于治疗3组。表明参附注射液与依达拉奉均能够减轻心肌缺血大鼠的氧化应激反应，且两种药物联合应用时的减轻效果更为显著。除了氧化应激反应以外，Wnt/β-catenin信号通路与也与心肌缺血再灌注损伤有关。据相关研究报道，在健康的心肌组织中，Wnt/β-catenin信号通路为失活状态，在出现缺血现象的心肌组织或者发生梗死的心肌组织中，Wnt/β-catenin信号通路则表现为过度活化的状态，该信号通路的活化可诱导心肌细胞发生凋亡，以及促进心室的重塑[14]。在本次研究中，对照组及治疗1、2、3组Wnt1、β-catenin表达水平均高于空白组。证实了心肌缺血大鼠相比健康大鼠的心肌组织发生了明显的Wnt/β-catenin信号通路活化。治疗1、2、3组Wnt1、β-catenin表达水平低于对照组，治疗1、2组Wnt1、β-catenin表达水平无显著差异，且该两组Wnt1、β-catenin表达水平均高于治疗3组。表明在再灌注前使用参附注射液与依达拉奉能够降低Wnt/β-catenin信号通路的活化状态，进而减少其诱导的心肌细胞凋亡等现象发生，当两种药物联合应用时可增大降低Wnt/β-catenin信号通路活化状态的程度，进而发挥更显著的保护效果。

综上所述，参附注射液与依达拉奉均对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，两种药物联合应用的效果得以显著增强，主要通过减轻氧化应激反应、调控Wnt/β-catenin通路相关蛋白发挥作用，进而改善心功能。