透骨血竭散外敷对类风湿性关节炎大鼠T细胞抗原受体通路中Lck、Fyn蛋白表达及滑膜细胞凋亡的影响

毕四丽，陈杜，姜如，邓文雯，肖智

（长沙市第三医院，湖南长沙 410000）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的以对称性多关节炎为主要特征的自身免疫性疾病，以关节疼痛、肿胀、僵直、变形为主要临床表现，发病率及致残率较高[1]。本课题组前期研究表明，外敷透骨血竭散对类风湿性关节炎患者治疗可直接用于病灶处，能迅速缓解关节疼痛，减轻患者痛苦，改善症状[2-3]，其机制与抑制白细胞介素（IL）-6及肿瘤坏死因子（TNF）-α表达进而减轻炎症反应及调节免疫有关[4]，但具体作用机制尚不完全清楚。RA的病情进展体现了炎症、自身免疫和滑膜增生这3种病理生理过程[5]。相关研究表明，T细胞在RA发生发展中起核心作用。T细胞是获得性免疫系统中的主要功能细胞，T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面关键的受体分子，可特异性地识别各种多肽抗原并通过胞内区免疫酪氨酸受体激活基序（ITAM）磷酸化传递抗原刺激信号，进而引发T细胞的免疫效应，其中以Src激酶（Lck、Fyn）所主导的蛋白磷酸化在跨膜信号传递及激活T细胞中发挥关键作用[6]。又有研究表明，RA的关节软骨和骨组织损害，与滑膜细胞的过度增生活化及凋亡不足密切相关[7]。因此，本研究通过建立RA大鼠模型，观察透骨血竭散外敷对RA大鼠TCR通路Lck、Fyn表达及滑膜细胞凋亡的影响，探讨透骨血竭散对RA大鼠关节的保护作用，以期为其临床应用治疗RA提供实验基础，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物取50只SPF级成年雄性SD大鼠，体质量200～250 g，鼠龄4～5周，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2019-0020。动物实验的实施严格遵照《实验动物护理和使用指南》。所有实验动物于开始实验前，适应环境饲养1周。

1.2 药物、试剂与仪器透骨血竭散由透骨草10 g、桂枝10 g、青风藤9 g、白芥子6 g、补骨脂10 g、土鳖虫6 g、当归10 g、艾叶10 g、白芍6 g、血竭6 g、红花6 g、忍冬藤10 g等组成，所有中药材均购自广州福东海药业；扶他林软膏（双氯芬酸二乙胺乳膏剂，北京诺华制药有限公司生产，批号：H19990291）。弗氏完全佐剂（FCA，美国Sigma公司）；Lck抗体、Fyn抗体[（艾比玛特医药科技有限公司（上海）]；Bax抗体、Bcl-2抗体（碧云天生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记亲和纯化山羊抗人IgG二抗、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海莼试生物有限公司）。JY-YLS-7C足容积测量仪（北京金洋万达科技有限公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；蛋白电泳仪（北京六一仪器）。

1.3 分组与造模将44只大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、透骨血竭散组及扶他林组，每组11只。除假手术组外，其他各组大鼠均参考文献方法[8]构建RA模型：将大鼠固定，1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用1 mL注射器在大鼠左足足垫皮下朝向踝关节方向注射0.1 mL弗氏完全佐剂。假手术组给予等体积0.9%氯化钠溶液同法注射。造模后2 h出现左侧足趾到踝部的急性炎症肿胀，造模后3 d左右出现左侧踝关节持续肿胀和颜色改变，对侧肢体或者前肢、耳、尾部发生红肿或者出现炎症结节，提示造模成功。

1.4 干预方法建模成功后，次日透骨血竭散组大鼠于左后足足跖部及踝关节外敷透骨血竭散（取药物研磨成末，清水调制成糊状）10 g·kg-1·d-1，扶他林组相同部位外敷扶他林软膏（0.4 g·kg-1·d-1），模型组、假手术组相同部位外敷空白凝胶膏剂（明胶32 g、聚丙烯酸钠5g、羧甲基纤维素钠2 g、聚乙烯吡咯烷酮5 g、甘油120 g、水140 mL），每日1次，每次4 h，连续给药21 d。干预过程观察并防止大鼠舔舐药物。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 继发侧足爪肿胀度[9]建模前及建模后第1天及治疗后第7、14、21天分别应用足容积测量仪测量大鼠左后足的肿胀体积（踝关节以下）、继发侧足肿胀度（△V）。△V=致炎后的足体积-致炎前的足体积。

1.5.2 HE染色法观察踝关节组织病理形态及炎症细胞浸润评分 末次治疗1 h后，采用颈部脱臼法处死大鼠，取踝关节置于10%甲醛溶液中固定，纵向切成2部分，放入脱钙剂中脱钙，后石蜡包埋切片4μm，低温保存。踝关节石蜡切片采用二甲苯脱蜡后按照100%-95%-85%及75%乙醇进行逐层脱水，苏木素染色10 min，盐酸（1%）处理，伊红复染，100%-95%-85%及75%乙醇脱水，封片后光学显微镜下观察组织形态。炎症细胞浸润评分标准[10]：无，计0分；轻度炎症，可见少量白细胞浸润，计1分；中度炎症，可见2个或以上的白细胞聚集物，计2分；重度炎症，出现白细胞融合及浸润显著，计3分。

1.5.3 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法观察踝关节滑膜细胞凋亡 踝关节滑膜切片逐层乙醇脱水，PBS冲洗3次，每次5 min，放入20μg/mL蛋白酶K溶液，23℃孵育30 min；PBS冲洗后，放入3%H2O2孵育15 min；PBS冲洗，擦片后放入50μL TUNEL反应液，37℃孵育60 min；PBS冲洗，加入50μL转化剂POD，DAB显色，苏木素进行复染3 min，0.2%氨水返蓝，逐层乙醇脱水，最后二甲苯透明、树脂封片。激光共聚焦显微镜下观察非凋亡细胞呈现蓝色，凋亡细胞呈棕黄色，每张切片选择5个非重叠视野，计算滑膜细胞凋亡率。滑膜细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5.4 蛋白免疫印迹法检测踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达 取踝关节组织用PBS冲洗后切碎，加入1 mL细胞裂解液，以10 000 g、4℃离心5 min；取上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法测总蛋白浓度。每孔上样蛋白20μg，十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）后于100 mA恒流下进行转膜，TBST洗膜3次，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗Lck（1∶500稀释）、Fyn（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。第2天，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶1 000稀释）室温孵育2 h，TBST洗膜3次，采用化学发光（ECL）法显影，使用ImageJ软件分析蛋白灰度值，计算目的蛋白与内参GADPH的灰度值比值。

1.5.5 免疫组织化学法检测踝关节滑膜组织中Bax、Bcl-2阳性表达 取踝关节滑膜组织切片，二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱水、抗原修复后，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭20 min。加入Bax抗体（1∶500稀释）、Bcl-2（1∶700稀释）抗体室温孵育1 h，加入HRP标记亲和纯化山羊抗人IgG二抗（1∶2 500稀释）37℃孵育20 min，滴加SABC 25℃孵育20 min，上述每次孵育后均用PBS冲洗。加3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色后，蒸馏水洗涤，苏木素复染5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片、晾干。200倍光学显微镜下，随机选择不重叠的5个视野，采用IPP 6.0图像分析系统计数阳性着色细胞百分比（Bax在细胞浆中呈现阳性棕黄色表达，Bcl-2在细胞膜中呈现阳性棕黄色表达），取平均值。

1.6 统计方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠足爪肿胀度比较表1结果显示：建模前，各组大鼠足爪肿胀度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。建模后第1天，与假手术组比较，其他各组大鼠足爪肿胀度均增加（P＜0.05）。治疗后第7、14、21天，与假手术组比较，模型组足爪肿胀度增加；与模型组比较，透骨血竭散组及扶他林组大鼠足爪肿胀度降低，透骨血竭散组更低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠足爪肿胀度比较Table 1 Comparison of rat paw swelling degree among various groups （±s，%）

表1 各组大鼠足爪肿胀度比较Table 1 Comparison of rat paw swelling degree among various groups （±s，%）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与扶他林组比较

组别假手术组模型组透骨血竭散组扶他林组F值P值鼠数/只11 11 11 11建模前1.60±0.10 1.55±0.21 1.59±0.14 1.62±0.12 0.332 0.855建模后第1天1.65±0.08 52.25±8.51①53.06±7.65①52.69±8.06①146.200＜0.001治疗第7天1.62±0.11 52.41±7.58①46.62±6.58①②③49.25±7.04①②168.900＜0.001治疗第14天1.65±0.12 53.06±8.04①43.24±5.96①②③46.39±6.03①②175.200＜0.001治疗第21天1.61±0.09 61.20±8.55①36.55±4.55①②③40.28±5.29①②220.600＜0.001

2.2 各组大鼠踝关节组织病理形态及炎症细胞浸润评分比较图1结果显示：假手术组大鼠踝关节滑膜上皮细胞排列整齐；模型组大鼠踝关节滑膜上皮增生明显，炎症细胞浸润并存在间质水肿，关节软骨层破坏严重，并形成血管翳；透骨血竭散组大鼠踝关节滑膜细胞紊乱改善，间质水肿缓解，仅存在少量炎症细胞；扶他林组踝关节滑膜上皮增生缓解，但仍有部分炎症细胞浸润。

图1 各组大鼠踝关节组织病理形态比较（HE染色，×200）Figure1 Comparison of histopathological morphology of rat ankle tissue among various groups（by HE staining，×200）

图2结果显示：假手术组、模型组、透骨血竭散组及扶他林组的炎症细胞浸润评分分别为（0.00±0.00）、（2.25±0.31）、（1.06±0.18）及（1.36±0.26）分。进一步比较，模型组炎症细胞浸润评分高于假手术组（P＜0.05）；与模型组比较，透骨血竭散组及扶他林组的炎症细胞浸润评分均降低（P＜0.05）；与扶他林组比较，透骨血竭散组大鼠炎症细胞浸润评分更低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠炎症细胞浸润评分比较Figure 2 Comparison of inflammatory cell infiltration score of rats among various groups（±s）

2.3 各组大鼠滑膜细胞凋亡率比较图3、图4结果显示，假手术组、模型组、透骨血竭散组及扶他林组的滑膜细胞凋亡率分别为（2.34±0.20）%、（1.66±0.17）%、（15.40±2.40）%及（12.41±1.74）%。进一步比较，与模型组比较，透骨血竭散组及扶他林组的滑膜细胞凋亡率均升高（P＜0.05）；与扶他林组比较，透骨血竭散组大鼠滑膜细胞凋亡率更高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠滑膜细胞凋亡情况（TUNEL法，×200）Figure 3 Apoptosis of synovial cells in various groups of rats（by TUNEL method，×200）

图4 各组大鼠滑膜细胞凋亡率比较（±s）Figure 4 Comparison of apoptosis rate of rat synovial cells among various groups（±s）

2.4 各组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达比较表2、图5结果显示：模型组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达水平高于假手术组（P＜0.05）；与模型组比较，透骨血竭散组及扶他林组的踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达水平均降低（P＜0.05）；与扶他林组比较，透骨血竭散组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达水平更低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达比较Table 2 Comparison of protein expression of Lck and Fyn in rat ankle tissue among various groups（±s）

表2 各组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白表达比较Table 2 Comparison of protein expression of Lck and Fyn in rat ankle tissue among various groups（±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与扶他林组比较

组别假手术组模型组透骨血竭散组扶他林组F值P值鼠数/只11 11 11 11 Lck蛋白相对表达量0.47±0.08 1.55±0.14①0.69±0.11①②③0.80±0.10①②201.100＜0.001 Fyn蛋白相对表达量0.36±0.06 0.95±0.09①0.62±0.12①②③0.71±0.14①②57.190＜0.001

图5 各组大鼠踝关节组织Lck、Fyn蛋白电泳图Figure 5 Electrophoretogram of protein Lck and Fyn in ankle tissue in various groups of rats

2.5 各组大鼠踝关节滑膜组织Bax、Bcl-2阳性细胞表达比较表3、图6结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织Bax阳性细胞比率降低，Bcl-2阳性细胞比率升高（均P＜0.05）；与模型组比较，透骨血竭散组及扶他林组的踝关节滑膜组织Bax阳性细胞比率升高，Bcl-2阳性细胞比率降低（均P＜0.05）；与扶他林组比较，透骨血竭散组大鼠踝关节滑膜组织Bax阳性细胞比率升高，Bcl-2阳性细胞比率降低（均P＜0.05）。

表3 各组踝关节滑膜组织Bax、Bcl-2阳性细胞比率比较Table 3 Comparison of the ratio of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle among various groups （±s，%）

表3 各组踝关节滑膜组织Bax、Bcl-2阳性细胞比率比较Table 3 Comparison of the ratio of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle among various groups （±s，%）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与扶他林组比较

组别假手术组模型组透骨血竭散组扶他林组F值P值鼠数/只11 11 11 11 Bax阳性细胞比率22.30±2.36 5.69±0.41①17.43±1.73①②③14.28±1.44①②198.700＜0.001 Bcl-2阳性细胞比率3.51±0.25 19.55±2.66①10.22±1.14①②③12.05±1.30①②188.900＜0.001

图6 各组踝关节滑膜组织Bax、Bcl-2阳性细胞分布情况（免疫组织化学法，×200）Figure 6 Distribution of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle joint in various groups（by immunohistochemistry，×200）

3 讨论

类风湿性关节炎（RA）归属于中医学“骨痹”的范畴，《济生方·痹》认为RA“皆因体虚，腠理空虚，感受风寒湿气而成痹也”。透骨血竭散具有祛风、活血、舒筋通络的功效，本研究结果表明，透骨血竭散外敷可减轻RA大鼠足爪肿胀、踝关节病理损伤及炎症细胞浸润。关节滑膜细胞增殖、大量粒细胞及巨噬细胞浸润可加剧关节破坏、畸形，增加关节能力丧失的发生风险[10-11]。提示透骨血竭散外敷可有效改善RA，与前期研究结果[2-4]一致。

类风湿性关节炎最具有特征性的病理改变是滑膜炎和血管翳的形成。滑膜细胞增殖是RA发生发展的病理基础，滑膜细胞异常增殖可促进血管翳形成，血管翳对关节软骨及骨质有较强的破坏作用，是RA患者关节畸形及功能障碍的主要原因[12]。因此，抑制滑膜细胞增殖，诱导滑膜细胞凋亡成为治疗类风湿关节炎的主要策略之一。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是调控细胞凋亡的重要因子。本研究结果显示，透骨血竭散外敷后RA大鼠踝关节滑膜细胞凋亡率升高，踝关节滑膜组织促凋亡蛋白Bax表达增强，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明透骨血竭散外敷可有效促进RA大鼠踝关节滑膜细胞凋亡。

滑膜炎症是RA的主要病理基础。Lck、Fyn均为T淋巴细胞抗原受体（TCR）下游分子，在T细胞免疫应答中均发挥信号传递作用，激活后可促进T细胞过度活化[13]。在RA发病过程中，Lck、Fyn可受丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核转录因子kappaB（NF-κB）及Janus激酶/信号转导子与转录激活子（JAK/STAT）炎症信号通路调控而加快RA疾病炎性反应[14]。Lck主要表达于T细胞中，在TCR交联后，Lck可磷酸化CD3+T细胞内的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），使下游信号转导通路异常激活，促进白细胞介素2（IL-2）的释放，最终引起炎症反应[15]。研究证实，Fyn过表达可增强TCR刺激T细胞反应，使酪氨酸磷酸化升高，Ca2+浓度增强，IL-2分泌增加，促进T细胞增殖，加重RA的滑膜炎症反应[13]。本研究结果显示，模型组大鼠踝关节组织中Lck、Fyn表达较正常组增强，透骨血竭散外敷组Lck、Fyn蛋白表达较模型组减弱，表明透骨血竭散外敷可通过抑制踝关节组织Lck、Fyn表达，改善RA大鼠踝关节肿胀。

综上所述，透骨血竭散外敷可改善RA大鼠踝关节的肿胀，其机制可能与抑制TCR信号通路Lck、Fyn蛋白表达，抑制炎症细胞浸润，促滑膜细胞凋亡有关。