木犀草素对抗2 型糖尿病大鼠心肌纤维化的机制研究

黄 婷，唐建东，李真真，白 杨，刘惠双，徐在革

（1.郑州市第七人民医院内分泌科，郑州 450006；2.郑州市第七人民医院营养科，郑州 450006）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是全球范围内常见的流行病，发病率和病死率逐年增高，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2D）约占DM 患者死亡的90%以上[1-2]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是DM 的主要并发症，其特征是左室舒张和/或收缩功能障碍，目前普遍认为心肌肥大和心肌纤维化是其主要的病理特征[3-4]。

近年来，随着中医药的快速发展，天然产物对疾病的预防效用成为研究热点[5]。木犀草素（luteolin，LUT）是一种天然的常见黄酮类化合物，可在多种植物和草药中提取，LUT 可作为一种抗氧化剂和抗炎剂，在多种疾病治疗等方面均有报道[6-7]。研究[8]证实，LUT 可明显抑制T2D 大鼠对胰岛素的抵抗作用及炎症反应。研究[9]发现，LUT 可明显改善阿霉素引起的H9C2 心肌细胞损伤。但还未见LUT 与T2D 心肌纤维化关系的相关报道。以往研究发现，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）-沉默信息调节因子3（sirtuin3，SIRT3）信号通路参与调控肝纤维化发展[10]，研究[11]发现，运动可能通过激活AMPK-SIRT3 信号通路改善T2D 大鼠骨骼肌胰岛素抵抗。关于AMPK-SIRT3 通路在T2D 心肌纤维化中的作用还未可知。笔者推测，LUT 可能通过激活AMPKSIRT3 信号对抗T2D 大鼠心肌纤维化，因此，本研究将通过体内和体外实验共同验证此猜想，并进一步探讨LUT 潜在的抗T2D 心肌纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SPF 级Sprague-Dawley（SD）大鼠24 只，体质量180～220 g，购自北京科兴中维生物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2020-0054。饲养期间自由进食饲料，自由饮水，12 h 昼夜循环，温度23～26℃。链脲佐菌素（streptozocin，STZ，纯度HPLC ≥98%）购自美国Sigma；LUT（纯度HPLC≥98%）、AMPK通路抑制剂Compound C（纯度HPLC ≥98%）购自上海aladdin；Masson 三色染色试剂盒购自北京Solarbio；RIPA 裂解液、CCK-8 细胞增殖检测试剂盒购自北京YITA；一抗fibronectin、collagen I、α-SMA、p-AMPK、AMPK 和SIRT3 及 二抗HRP 标记的山羊抗兔均购自英国Abcam；H9C2细胞购自美国ATCC；DEME 培养基购自上海LMAI Bio；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京BIOSIC；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（显色法）购自上海Beyotime。BPH-9042 细胞培养箱购自上海一恒；Multiskan FC 酶标仪购自美国Thermo；CX43 生物显微镜、FV3000 激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus；Gallios 流式细胞仪购自美国BECKMAN。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及药物处理 SD 大鼠适应性喂养7 d后，分为正常（Control）组，T2D 组，T2D+LUT 组，每组8 只。T2D 组和T2D+LUT 组SD 大鼠禁食12 h后通过腹腔注射1% 35 mg/kg STZ 诱导T2D 模型，注射后继续喂食高脂高糖饲料，持续7 d 后，于大鼠尾部静脉取血检测血糖，当超过3 次随机检测血糖浓度≥16.7 mmol/L 则表明T2D 模型制备成功[12]。Control 组腹腔注射相同体积的柠檬酸钠缓冲液，并一直使用普通饲料喂养。T2D+LUT 组大鼠于造模成功后第1 天开始灌胃给予40 mg/kg LUT[8]，Control 组和T2D 组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，每天1 次，持续4 周。实验结束后大鼠腹腔注射3% 50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉，收集各组大鼠左心室心肌组织样本，部分组织用4%多聚甲醛固定后制作4 mm 的石蜡切片；其余组织冻存于-80℃，用于Western blot 检测。

1.2.2 Masson 染色观察心肌组织病理学并测定心肌胶原容积分数 取1.2.1 中获取的各组组织切片按照常规操作脱蜡，参照Masson 三色染色试剂盒说明书进行Masson 染色，大鼠心肌细胞染色呈红色，间质胶原纤维呈蓝色，使用光学显微镜观察拍摄大鼠心肌结构及纤维化程度。通过Image Pro Plus 测定各组心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF（%）=胶原面积/视野总面积×100%。

1.2.3 Western blot 检测心肌组织中纤维化标志蛋白及AMPK-SIRT3 通路相关蛋白水平 取出冻存的各组心肌组织，每100 mg 组织加入1 mL 预冷的RIPA 裂解液通过超声破碎后离心提取上清液，使用BCA 试剂盒检测各组蛋白浓度。按照1: 5 比例混合蛋白和上样缓冲液后，在95℃煮沸15 min 使蛋白变性。按照40 mg总蛋白上样，经SDS-PAGE 分离蛋白后经半干法将蛋白转移至PVDF 膜上。使用5%牛血清白蛋白封闭1 h，洗去封闭液后添加一抗fibronectin、collagen I、α-SMA、p-AMPK、AMPK 和SIRT3（稀释比例1: 1 000）4 ℃过夜孵育，隔天使用TBST 洗膜后，添加HRP 标记的山羊抗兔二抗（稀释比例1: 5 000）在37 ℃孵育1 h，使用TBST 冲洗后，添加ECL 显影，在凝胶成像系统中曝光，保存图片。使用Image J 软件分析各蛋白条带的灰度值，β-actin 作为内参蛋白。目的蛋白的相对表达量=实验组目的蛋白的灰度值/对照组蛋白的灰度值。

1.2.4 心肌细胞H9C2 培养 H9C2 细胞维持在DEME培养基中（含1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清），在37℃培养箱中培养，至细胞融合度达到0%～90%，即可进行传代培养。

1.2.5 LUT 浓度及干预时间选择 取对数期且生长状态良好的H9C2 细胞接种于6 孔板中（1×104个/孔），依次分为对照组（Control），高糖组（HG），高糖和不同浓度LUT 组[HG+LUT（5、10、15 mM）]。Control 组为常规培养条件添加5.5 mmol/L 葡萄糖，HG 组为常规培养条件下添加30 mmol/L 葡萄糖[13]，HG+LUT（5、10、15 mM）组为常规培养条件下添加30 mmol/L 葡萄糖和不同浓度（5、10、15 mM）的LUT，分别干预处理24、48、72 h 后收集细胞，通过CCK-8 法检测各组细胞的增殖情况。

1.2.6 细胞分组 取对数期且生长状态良好的H9C2细胞接种于6 孔板中，依次分为Control 组、HG组、HG+LUT 组、AMPK通路抑制剂（Com.C）组（10 mM）[14]、高糖+LUT+AMPK通路抑制剂（HG+LUT+Com.C）组。Control 组，HG 组参照1.2.5中方法处理，HG+LUT 组为常规培养条件下添加30 mmol/L 葡萄糖和5 mM LUT，Com.C 组为常规培养条件下添加10 mM Compound C，HG+LUT+Com.C 组为常规培养条件下添加30 mmol/L 葡萄糖、5 mM LUT和10 mM Comound C，以上各组细胞均培养48 h。

1.2.7 流式细胞术检测各组H9C2 细胞凋亡率 将按照1.2.6培养的各组H9C2细胞接种于96孔板中（1×106个/孔），添加200 mL 结合缓冲液重悬细胞，分别添加5 mL Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI），混匀后室温避光孵育20 min，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.8 TUNEL 法检测各组H9C2 细胞凋亡水平 收集按照1.2.6 培养的各组H9C2 细胞，使用4%多聚甲醛固定15 min，按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明操作，最后添加DAB 反应10 min。在荧光显微镜下观察拍照，记录每个视野下凋亡的细胞数量。TUNEL 阳性细胞率=单个视野下的凋亡细胞数量/单个视野下的总细胞数量×100%。

1.2.9 Western blot 检测各组H9C2 细胞中纤维化标志蛋白及AMPK-SIRT3 通路相关蛋白水平 收集按照1.2.6 培养的各组细胞，通过RIPA 法提取总蛋白，参照1.2.3 方法分析各蛋白水平。

1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism 9.0 对数据进行分析，多组间比较采用One-way ANOVA分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05 代表数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LUT 对STZ 诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化和AMPK-SIRT3 通路的影响 与Control 组相比，T2D组大鼠心肌组织中细胞排列紊乱，间质胶原纤维分布增加，CVF 显著增大；与T2D 组相比，T2D+LUT 组大鼠心肌组织中细胞排列紊乱及间质胶原纤维分布增加得到改善，CVF 显著降低，见图1；心肌组织中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平显著增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平显著降低（P＜0.05）。心肌组织中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平显著降低，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3蛋白水平显著增高（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组相关蛋白水平比较（，n =3）

表1 各组相关蛋白水平比较（，n =3）

注：与Control 组比较，# P ＜0.05；与T2D 组比较，△P ＜0.05

图1 Masson 染色观察心肌组织病理学

2.2 LUT 对HG 诱导的H9C2 细胞增殖活力的影响 HG 组H9C2 细胞增殖活力较Control 组明显降低（P＜0.05）；在HG 处理的同时添加不同剂量的LUT 处理48 h 和72 h 后H9C2 细胞增殖活力较HG组得到明显的改善（P＜0.05），在处理24 h 时HG+LUT（5 mM）组H9C2 细胞增殖活力则与HG组无明显差异（P＞0.05）。因此，为避免较高浓度的LUT 对细胞生长产生不利影响，故而选择5 mM 的LUT 处理48 h。结果见表2。

表2 LUT 促进HG 诱导的H9C2 细胞增殖（，n =3）

表2 LUT 促进HG 诱导的H9C2 细胞增殖（，n =3）

注：与Control 组比较，# P ＜0.05；与HG 组比较，△P ＜0.05；与HG+LUT（5 μM）组比较，▲P ＜0.05；与HG+LUT（10 μM）组比较，□P ＜0.05

2.3 LUT 对HG 诱导的H9C2 细胞凋亡、纤维化及AMPK-SIRT3 通路的影响 与Control 组相比，HG 组H9C2 细胞凋亡率和TUNEL 阳性细胞率明显升高（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+LUT 组H9C2 细胞凋亡率和TUNEL 阳性细胞率明显降低（P＜0.05）。见图2，图3。进一步研究发现，与Control 组相比，HG 组H9C2 细胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明显增高（P＜0.05）；此外，p-AMPK/AMPK比值和SIRT3 蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与HG组相比，HG+LUT 组H9C2 细胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明显降低（P＜0.05）；此外，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明显升高（P＜0.05），结果见表3。

图2 流式细胞术检测各组H9C2 细胞凋亡率

图3 TUNEL 法检测各组H9C2 细胞凋亡水平

表3 各组H9C2 细胞凋亡水平及蛋白表达比较（，n =3）

表3 各组H9C2 细胞凋亡水平及蛋白表达比较（，n =3）

注：与Control 组比较，# P ＜0.05；与HG 组比较，△P ＜0.05；与HG+LUT 组比较，▲P ＜0.05

2.4 AMPK 通路抑制剂可以逆转LUT 的治疗作用 与HG 组相比，Com.C 组H9C2 细胞凋亡率和TUNEL 阳性细胞率明显增高；且细胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明显增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明显降低（P＜0.05）。与HG+LUT组相比，HG+LUT+Com.C 组H9C2 细胞凋亡率和TUNEL 阳性细胞率明显增高；且细胞中fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平明显增高，p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

心肌细胞纤维化是DCM 的突出病理特征之一，同时，T2D 心肌纤维化是导致心力衰竭的主要原因[15]。目前对DCM 的治疗主要依赖部分化学药物，如胰岛素等，通常具有较大的副作用，效果不理想，缺乏针对性的DCM 治疗方法。究其原因可能是因传统化学药物作用靶点单一。传统的中药具有多靶点协同作用的优势，因此，有必要寻找新的、更安全有效的传统中药以控制和治疗DCM[16]。本研究通过STZ 复制T2D 大鼠模型，后给予LUT 处理，发现LUT 可明显改善T2D 大鼠心肌组织中细胞排列紊乱及间质胶原纤维分布增加情况，且CVF 亦显著降低，此外，LUT 可明显逆转T2D 大鼠心肌组织中fibronectin、collagen I 和α-SMA的高表达。fibronectin、collagen I 和α-SMA 属于纤维化标志蛋白，增加其表达，肝肾纤维化程度也显著增加[17-18]。本研究结果表明，LUT 可能抑制STZ诱导的大鼠心肌组织纤维化。

纤维化是一个常见且复杂的病理生理过程，AMPK 是一个参与保持机体物质与能量平衡的重要分子。以往大量研究证实，AMPK 参与多种疾病的发生发展，且在调控纤维化的过程中发挥着重要的作用[19-20]。研究[21]发现，柚皮素可通过激活AMPK 相关通路增强抗氧化反应，减轻心肌纤维化进而明显削弱DM 小鼠的心肌损伤。在多种疾病模型中，SIRT3已被报道为AMPK 的下游效应物，AMPK-SIRT3 信号的激活有助于改善线粒体功能，缓解疾病的进展[22-23]。研究[24]表明，雷公藤红素可通过激活AMPK-SIRT3 信号促进抗炎作用，减轻肝纤维化。本研究结果显示，在STZ 诱导T2D 模型中，大鼠心肌组织中p-AMPK/AMPK 比值和SIRT3 蛋白水平显著降低，但经LUT 处理后，p-AMPK/AMPK比值和SIRT3蛋白水平明显回升，以上结果表明，在体内，LUT 可能通过激活AMPKSIRT3 信号参与调控大鼠的心肌纤维化。

为进一步验证LUT 是否通过激活AMPK-SIRT3 信号参与调控大鼠的心肌纤维化，本研究在体外培养心肌细胞H9C2。首先，通过检测LUT 对H9C2 细胞增殖活力的影响，筛选LUT 合适的作用浓度和处理时间，发现LUT 可促进HG 诱导的H9C2 细胞增殖；其次，通过检测LUT 对H9C2 细胞凋亡的影响，发现LUT可显著降低HG 诱导的H9C2 细胞高凋亡率，表明LUT 参与调控H9C2 细胞增殖及凋亡过程。为进一步探究LUT 对心肌细胞纤维化的影响，本研究通过检测fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平发现，LUT可明显降低HG 诱导的H9C2 细胞中高fibronectin、collagen I 和α-SMA 蛋白水平，同时，LUT 还可明显改善HG对AMPK-SIRT3信号的抑制作用。以上结果表明，在体外，LUT 可能通过激活AMPK-SIRT3 信号参与调控心肌细胞纤维化，与体内结果一致。为更深入的探究LUT 与AMPK-SIRT3 信号的关系，本研究通过添加AMPK 抑制剂干预AMPK-SIRT3 信号，发现AMPK抑制剂与LUT 作用相反，且抑制AMPK-SIRT3 信号可逆转LUT 对心肌细胞的治疗作用。

综上所述，LUT 通过激活AMPK-SIRT3 信号对抗T2D 大鼠心肌纤维化，本研究为临床上使用LUT 治疗T2D 心肌纤维化提供了理论依据。但本研究并未在大鼠体内使用通路抑制剂完善结论的可信度，且本研究仅是探究了LUT 对AMPK-SIRT3 信号的影响，并未对其他的作用靶点进行研究，故尚存在一定的局限性，仍需后续更深入的研究。