响应面法优化山楂叶多酚微波-超声辅助提取工艺及其降糖活性研究

陈旭，卢静静，王涵驰，李延华

（1.武汉设计工程学院食品与生物科技学院，武汉 430205；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018）

山楂在我国有两千多年食用和药用历史。山楂叶中富含黄酮、多酚及三萜类化合物等活性成分，具有预防心血管疾病、降糖、降脂、抗氧化、抑菌等功效。目前对山楂叶中活性物质研究主要集中在黄酮类化合物提取、功能特性等，对多酚类物质研究较少。

多酚类化合物广泛存在于植物中，具有抗菌、消炎、抗癌、抗氧化等生理功能，近年研究表明，天然多酚还具有降血糖功效。Prathapan等研究发现木橘果肉多酚提取物可剂量依赖性抑制α-淀粉酶和α-葡糖苷酶活性，有效降低血糖，预防糖尿病[1]。目前，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶合成抑制剂药物，如阿卡波糖、二甲双胍等是糖尿病患者常用药物，但对人体有副作用，寻找天然降血糖物质成为研究重点，具有降糖活性的山楂叶多酚高效制备受到学界关注。

多酚传统提取方法主要为有机溶剂、索氏提取法等。刘继攀等采用水溶剂提取真姬菇多酚，提取4 h时，多酚得率最高[2]。多酚具有一定抗氧化能力，但这类方法耗时长、效率低、提取物活性低。近年来，在溶剂提取基础上辅以微波和超声等现代技术，可有效提高多酚提取率并保护其生物活性。杨立风等采用微波辅助提取黑枸杞多酚，结果显示，微波时间6 s时，多酚提取得率可达（3.58±0.07）%，对DPPH自由基清除率可达（85.76±1.40）%[3]。郝霄鹏研究指出，微波辅助提取效率高，可有效保护活性成分[4]。李映新等优化超声波辅助提取黑老虎果皮多酚工艺条件，超声提取50 min，总多酚得率为（2.03±0.04）%，且该多酚对DPPH和ABTS+自由基清除率均在90%以上[5]。D'Alessandro等研究发现，相同条件下，超声波提取野樱莓多酚提取率显著高于未使用超声波[6]。可见，微波和超声处理可有效促进多酚物质溶出，提高多酚提取效率，较好保持其生物活性。

本研究将两种提取方法相结合，以山楂叶为原料，采用微波预处理和超声波辅助提取法，探讨乙醇浓度、超声温度、超声时间、液料比对山楂叶多酚得率的影响，通过Box-Behnken优化山楂叶多酚提取工艺，在此基础上检测多酚对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制效果，测定小鼠血糖、胰岛素含量、脏器指数和相关代谢酶等指标探讨其降糖作用。研究可为山楂叶多酚高效制备及降糖功能性食品、低糖食品添加剂开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山楂叶，购自山东临沂爱康药业有限公司；没食子酸标准品、无水乙醇、福林酚、NKA-9大孔树脂、α-淀粉酶（活力≥250 U·mg-1）、α-葡萄糖苷酶（活力≥50U·mg-1Protein），购自武汉华玖医药科技有限公司；链脲佐菌素（STZ），购自北京索莱宝生物工程有限公司；盐酸二甲双胍缓释片，购自山东司邦得制药有限公司；葡萄糖（YX-CB500）、胰岛素（KLC9037）、糖原（BC0345）、糖化血红蛋白（YB-E12235）、谷丙转氨酶（C009-1）、谷草转氨酶（C010-1）测定试剂盒，购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验动物

实验动物为昆明小鼠，体重（20±2）g，标准环境下喂养1周，试验过程中对小鼠所有处置均按《实验动物管理条例》规定执行。

1.3 试验设备

HHA-4数显恒温水浴锅，购自杭州聚同电子有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限公司；ES120A电子天平，购自厦门莱斯德科学仪器有限公司；R206B旋转蒸发器，购自上海旦鼎国际贸易有限公司；G80F23CN3L-Q6（P0）型微波炉，购自广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；NYUC-150NP型数控超声波清洗器，购自无锡诺源仪器设备有限公司；WD2102型自动酶标仪，购自北京市六一仪器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 山楂叶微波预处理

山楂叶，60℃干燥24 h，粉碎，过50目筛。取山楂叶粉，加入5倍石油醚，室温搅拌24 h，脱脂处理，烘干备用[7]。精确称取脱脂后山楂叶粉2 g放入直径90 mm培养皿中，加入蒸馏水，使之均匀润湿，静置一段时间，将充分润湿山楂叶粉放入微波炉，在微波功率为350 W条件下，微波90 s预处理，收集预处理后样品，备用[8]。

1.4.2 山楂叶多酚超声辅助提取工艺研究

1.4.2.1单因素试验

以多酚得率为测定指标，分别研究乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比（30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL·g-1））、超声温度（50、55、60、65、70℃）和超声时间（10、15、20、25、30 min）对山楂叶多酚得率的影响。

1.4.2.2响应面试验设计

根据单因素试验结果进行Box-Behnken试验设计[9]，因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.4.2.3多酚得率测定

以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法(FC法)测定多酚含量[10]。

标准曲线回归方程为Y=0.133X+0.035，R2=0.9985，线性关系良好。根据标准曲线计算多酚浓度，计算公式如下：

式中，Y为山楂叶提取液多酚得率（%）；C为测定液多酚质量浓度（mg·mL-1）；N为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；W为山楂叶干粉末质量（g）。

1.4.3 山楂叶多酚纯化处理

参照文献[11]方法，利用NKA-9大孔树脂纯化山楂叶多酚，上样液浓度为2 mg·mL-1，pH为5.0，体积为350 mL，进样流速为1 mL·min-1，充分吸附，采用120 mL 70%乙醇以1 mL·min-1速度动态洗脱，冷藏备用纯化后山楂叶多酚。

1.4.4 山楂叶多酚体外降糖效果

1.4.4.1山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用

参照文献[12]方法，以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，阿卡波糖为对照，在波长为400 nm处检测，明确山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制效果。

按如下公式计算：

式中，A0为空白吸光值；A1为样品吸光值；A2为样品背景吸光值。

1.4.4.2山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制作用

参照文献[13]方法，以α-淀粉酶抑制率为指标，阿卡波糖为对照，在波长为540 nm处检测，研究山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制效果。

式中，A0为空白吸光度值，A1为样品吸光度值；A2为对照吸光度值。

1.4.5 山楂叶多酚体内降糖效果

1.4.5.1糖尿病小鼠模型的建立、分组与给药

取部分小鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ（320 mg·kg-1），72 h后，检测血糖，选取血糖浓度＞11 mmol·L-1小鼠为合格糖尿病模型[14]。

取健康小鼠10只为正常对照组（Con），另取糖尿病小鼠60只分为模型组（Mod）、二甲双胍（60 mg·kg-1）对照组（Met）、山楂叶多酚600（H）、400（M）、200（L）mg·kg-1剂量组，每组10只；灌胃给药，1次·d-1，连续4周，给药期间检测相关指标。

1.4.5.2指标测定

给药期间，分别于第0、4、8、12、16、20、24、28天，小鼠禁食12 h，眼眶静脉取血，测定血糖含量；给药第28天，一次性灌胃葡萄糖2 g·kg-1，尾静脉取血测定0、0.5、1、2 h血糖含量；解剖小鼠称取适量肝脏、胰腺，检测肝糖原含量、肝脏及胰腺指数；按照试剂盒说明书，分别测定小鼠血清胰岛素水平、糖化血红蛋白含量、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性。

1.5 数据处理与分析

采用SPSS 23.0、Excel 2020和Design-Expert 8.0.6软件分析数据，通过ANOVA判定（Tukey′s检验）不同组间差异显著，通过t检验判定两组间显著性差异，P＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 山楂叶多酚提取工艺研究

2.1.1 各单因素对山楂叶多酚得率的影响

由图1a可知，在40%~60%范围内，山楂叶多酚得率随乙醇浓度增加而增大，当乙醇浓度为60%时，多酚溶出量达高峰，多酚得率最高为0.63%，当乙醇浓度＞60%，多酚得率逐渐下降。

液料比对山楂叶多酚得率影响如图1b所示，山楂叶多酚得率随液料比增加呈先增后减趋势，当液料比为50∶1时，多酚得率高达0.65%，继续增大液料比山楂叶多酚得率下降。

由图1c可知，温度升高，山楂叶多酚得率增加，超声温度55℃时，多酚得率最高，温度继续升高多酚得率反而下降。

超声时间对山楂叶多酚得率影响如图1d所示，随超声时间增加，山楂叶多酚得率先增后减，超声20 min时，多酚得率最高为0.68%，继续增加超声时间多酚得率下降。

图1 各因素对山楂叶多酚得率的影响Fig.1 Effects of various factors on the yield of polyphenols from Hawthorn Leaves

2.1.2 响应面优化试验结果

2.1.2.1 Box-Behnken试验回归模型的建立及方差分析

选择乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为自变量，山楂叶多酚得率为响应值，利用Box-Bohnken法优化提取试验。Box-Behnken试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface test results

对表2中数据进行回归分析，得到二次回归模型如下：

多酚得率=0.64-4.167×10-3A+1.667×10-3B+0.072C+0.085D-0.095AB+5×10-3AC-0.063AD-0.080BC-0.030BD+0.032CD-0.012A2-0.018B2-0.089C2-0.18D2

由表3可知，模型P＜0.0001，多酚得率与各自变量之间回归关系极显著，失拟项P=0.8335＞0.05，不显著，说明该试验数据和模型符合度高，试验可靠。回归模型下，C、D、AB、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2达 到差 异 极 显 著 水 平（P＜0.01），A、B、AC差异不显著（P＞0.05）。R2=0.9975，R2adj=0.9951，两系数较接近，说明得率理论值与实际值拟合良好。由F值可知，各因素对山楂叶多酚得率影响顺序为D（超声温度）＞C（超声时间）＞A（乙醇浓度）＞B（液料比）。

表3 Box-Behnken试验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken test

2.1.2.2响应面试验中交互项作用

由图2可知，乙醇浓度与液料比等高线呈马鞍形，乙醇浓度与超声时间、乙醇浓度与超声温度、液料比与超声时间、超声时间与超声温度等高线图呈椭圆形，说明4个因素两两间交互作用显著，其中超声时间与超声温度曲面图坡度最陡，说明二者之间交互作用对山楂叶多酚得率影响显著。

图2 各因素交互对山楂叶多酚得率影响的响应面及等高线图Fig.2 Response surface of interaction of various factors on polyphenols yield of hawthorn leaves

2.1.2.3提取工艺优化

通过响应面优化得到多酚提取最佳条件为乙醇浓度70.18%、液料比40.55∶1（mL·g-1）、超声时间24.98 min、超声温度56.39℃，多酚得率理论预测值为0.77%。为验证响应面试验结果，且便于实际操作，将条件调整为乙醇浓度70%、液料比40∶1（mL·g-1）、超声时间25 min、超声温度56℃，3次平行试验得到山楂叶多酚得率平均值为0.75%，结果与预测值接近，具有一定实用价值。

2.2 山楂叶多酚体外降糖研究

2.2.1 山楂多酚对α-淀粉酶活性的影响

由图3可知，随山楂叶多酚浓度增加，其对α-淀粉酶抑制作用逐渐增强，山楂叶多酚IC50为1.05 mg·mL-1，低于阿卡波糖1.33 mg·mL-1，在浓度为4.5 mg·mL-1时，山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制率可达88.5%。尹国利等研究表明，苦丁茶多酚对α-淀粉酶抑制IC50值为1.31 mg·mL-1[15]，本研究制备的山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制效果与其研究结果相近，说明山楂叶多酚可有效抑制α-淀粉酶活性，可作为较强α-淀粉酶活性抑制剂。

图3 山楂叶多酚对α-淀粉酶抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of hawthorn leaf polyphenols on α-amylase

2.2.2 山楂多酚对α-葡萄糖苷酶活性的影响

由图4可知，山楂叶多酚浓度增加，其对α-葡萄糖苷酶抑制率也增大，山楂叶多酚IC50为1.89 mg·mL-1，低于阿卡波糖2.01 mg·mL-1，在浓度为4.5 mg·mL-1时，抑制率可达82.8%。尹国利等研究结果显示，苦丁茶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制IC50为1.15 mg·mL-1[15]；林宝妹等研究表明，嘉宝果叶片多酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制IC50值小于阿卡波糖[16]，本研究制备山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制效果与上述研究结果相近。说明山楂叶多酚可作为较好α-葡萄糖苷酶活性抑制剂。

图4 山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of hawthorn leaf polyphenols on α-glucosidase

2.3 山楂叶多酚体内降糖研究

2.3.1 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血糖值的影响

由图5可知，第0天时，与正常组相比，模型组小鼠FBG显著增加（P＜0.05），此时糖尿病小鼠FBG大于11.1 mmol·L-1，表明造模成功。

图5 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血糖值的影响Fig.5 Effects of hawthorn leaf polyphenols on blood glucose level in diabetic mice

喂养过程中，正常组和模型组FBG均无明显变化，而对照组和山楂叶多酚各剂量组FBG逐渐下降，高剂量组与对照组下降幅度最大，且在第4天后高剂量组FBG低于对照组，说明山楂叶多酚各剂量组对糖尿病小鼠有降低空腹血糖值作用，高剂量组作用更为显著。

2.3.2 山楂叶多酚对糖尿病小鼠糖耐量的影响

由图6a可知，口服葡萄糖溶液后，小鼠血糖值呈先升后降趋势，在30 min时，各组血糖达到峰值，其中糖尿病小鼠组血糖升高明显，均高于18 mmol·L-1，正常组血糖升高不明显，在10 mmol·L-1以下。随时间延长，各组血糖迅速下降，120 min时，高剂量组和对照组血糖值与正常组最接近，中剂量组比正常组稍高，而低剂量组和模型组仍高于15 mmol·L-1。可见，高剂量山楂叶多酚对改善糖尿病小鼠糖耐量效果最显著，中剂量稍差，低剂量作用不明显。

由葡萄糖曲线下面积AUC图6b可知，对照组和各剂量组均可一定程度降低AUC，高剂量和对照组降低最为显著（P＜0.01），与正常组接近，且显著低于模型组，而低剂量组降低程度最小，AUC与模型组接近，说明山楂叶多酚能够提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，高剂量组能力更强。

图6 山楂叶多酚对糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.6 Effects of hawthorn leaf polyphenols on glucose tolerance in diabetic mice

2.3.3山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响

由图7a可知，模型组血清胰岛素含量（8.22 mIU·L-1）比正常组（4.95 mIU·L-1）高，且差异显著（P＜0.01），与模型组相比较，给药组均明显降低（P＜0.01），且高剂量组与对照组接近，可有效降低小鼠血清胰岛素水平。

由图7b、7c可知，与正常对照组比较，模型组HOMA-IR明显升高（P＜0.01），HOMA-IS明显降低（P＜0.01），说明胰岛素抵抗升高，受体敏感性降低。给药剂量组均可降低HOMA-IR，增加HOMAIS，且高剂量组效果最显著。因此，山楂叶多酚可有效降低小鼠血清胰岛素水平，缓解胰岛素抵抗，且呈剂量依赖性。

图7 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响Fig.7 Effects of hawthorn leaf polyphenols on serum insulin level in diabetic mice

2.3.4 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清糖化血红蛋白的影响

由图8可知，模型组小鼠血清糖化血红蛋白（GHb）与正常组小鼠相比显著升高（P＜0.01），GHb结果与空腹血糖结果一致。对照组和山楂叶多酚各剂量组血清GHb比模型组小鼠明显降低（P＜0.01），且给药组随用药剂量增加，血清GHb值逐渐下降，高剂量组与对照组更接近正常水平。说明高剂量山楂叶多酚有效改善糖尿病小鼠持续高血糖状态。

图8 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清糖化血红蛋白的影响Fig.8 Effects of hawthorn leaf polyphenols on serum glycosylated hemoglobin in diabetic mice

2.3.5 山楂叶多酚对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响

如图9所示，与正常组（15.28 mg·g-1）比较，模型组（14.85 mg·g-1）肝糖原含量下降，但差异不显著。对照组和山楂叶多酚各剂量组均可提高小鼠肝糖原含量，且高剂量组肝糖原含量与模型组相比升高显著(P＜0.01)。由此可知山楂叶多酚能提高体内肝糖原含量，降低血糖。

图9 山楂叶多酚对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响Fig.9 Effects of hawthorn leaf polyphenols on liver glycogen content in diabetic mice

2.3.6 山楂叶多酚对糖尿病小鼠肝脏、胰腺指数的影响

由图10a可知，与正常组相比，模型组小鼠肝脏指数上升显著（P＜0.01），与模型组相比，山楂叶多酚低、中剂量组及对照组小鼠肝脏指数显著降低（P＜0.01），说明山楂叶多酚可缓解糖尿病小鼠肝脏病变损伤。

图10b显示，较正常组比较，模型组小鼠胰腺指数显著降低（P＜0.01），与模型组相比，对照组和山楂叶多酚各剂量组小鼠的胰腺指数显著升高（P＜0.01），与对照组相比，山楂叶多酚低剂量组差异明显，说明山楂叶多酚可降低小鼠胰腺病变。

图10 山楂叶多酚对糖尿病小鼠肝脏、胰腺指数的影响Fig.10 Effects of hawthorn leaf polyphenols on liver and pancreatic index of diabetic mice

2.3.7 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清ALT和AST含量的影响

图11可知，模型组ALT和AST活性较正常组明显增强（P＜0.01），与模型组相比，给药组活性均降低，且高剂量组ALT和AST活性下降更明显（P＜0.01），活性与正常组接近，说明其对肝细胞保护效果最佳，由此可见，山楂叶多酚有效抑制肝细胞中ALT和AST释放，有助于修复糖尿病小鼠受损肝细胞，对糖尿病小鼠肝脏具有良好保护作用。

图11 山楂叶多酚对糖尿病小鼠血清ALT和AST含量的影响Fig.11 Effects of hawthorn leaf polyphenols on serum ALT and AST levels in diabetic mice

4 讨论与结论

微波、超声辅助提取均具有时间短、效率高以及提取物生物活性高的特点。陈旭等研究仅采用超声辅助提取山楂叶多酚，得率为0.65%[17]，本研究结合二者优点，采用微波-超声联合辅助提取山楂叶多酚，得率增加至0.75%，且提取多酚降糖活性与已往结果相近[17]，说明本研究提取方法可保护其活性，提高多酚提取效率。

影响多酚得率主要因素是乙醇浓度、液料比、超声温度和超声时间，山楂叶多酚得率随各因素增大呈相似变化趋势，即先增后减，因为多酚与乙醇水体系极性相近，当乙醇浓度增加、液料比增大、超声时间延长时，山楂叶与乙醇充分接触，山楂叶多酚溶解度增大使得山楂叶多酚溶出量增加；同时超声温度升高，多酚分子运动速度加快，加速多酚溶出，直至多酚溶出量达到饱和；然而，当进一步增加乙醇浓度、液料比、延长超声时间时，其他醇溶杂质溶出量随之增加，且温度过高加剧多酚氧化而破坏其结构，导致多酚得率下降。该结论与刘永等和许玲玉等研究结论一致[18-19]。

糖尿病是一种常见代谢性疾病，发病率逐年增加，主要表现为血糖升高。碳水化合物进入机体后，在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用下水解为葡萄糖，导致血糖升高，因此，抑制这两种酶的活性，可降低葡萄糖进入血液速率。本文通过测定优化工艺后提取的山楂叶多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率，评价其体外降糖活性，结果显示其对两种酶抑制作用随山楂叶多酚浓度增加逐渐增强，且稍高于阿卡波糖，在其浓度为4.5 mg·mL-1时，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分别为88.5%和82.8%，该结论与尹国利和林宝姝研究结果相近[15-16]，说明提取的山楂叶多酚有较强体外降糖作用；为进一步验证山楂叶多酚降糖效果，进行小鼠体内试验，结果显示山楂叶多酚有效降低糖尿病小鼠空腹血糖、血清胰岛素水平、GHb含量、肝脏指数及ALT和AST活性，提高小鼠肝糖原含量、胰腺指数，呈剂量依赖，且高剂量山楂叶多酚组能力更强，说明山楂叶多酚具有较好体内降糖活性，与赵梦雅等研究结果相近[14]。

本研究通过响应面试验优化微波-超声提取山楂叶多酚，乙醇浓度70%、液料比40∶1（mL·g-1）、超声时间25 min、超声温度56℃时，山楂叶多酚得率为0.75%；体外试验结果显示，山楂叶多酚体外对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有较强抑制作用；体内试验结果表明，山楂叶多酚具有较好体内降糖能力，且高剂量时降糖效果更佳。