预混合饲料中维生素A、D3 和E快速联检的高效液相色谱法

段春宇

（山东省莒南县检验检测中心 山东临沂 276600）

脂溶性维生素是畜禽维持健康、生长、繁殖和生产所必需的一类有机微量营养物质。脂溶性维生素对于畜禽体内的代谢活动具有调节作用，促进生长，增强动物抗病和抗应激能力，一般情况下，畜禽不能合成或难以合成足量的维生素满足自身的需要，必须由日粮提供，但是饲料中的含量也是有限的，不够满足养殖业对于所饲喂畜禽快速、健康生长的需求，在饲料中添加适量维生素是保障畜禽健康的重要途径。

脂溶性维生素对畜禽生长具有重要作用，但是需要量是微量的，过多摄入会导致畜禽中毒，农业部1224 公告制定了推荐用量和最高限量，因此饲料生产企业与养殖企业要根据饲养的不同畜禽品种与畜禽生长阶段对维生素的营养需要量进行调控，这就需要准确检测饲料中脂溶性维生素的含量，尤其是预混合饲料中脂溶性维生素的含量，准确检测，精准调控，既满足畜禽营养，又符合国家规范要求。

国家标准对于VA、VD、VE 的检测是分开三个标准方法，对于检测任务繁重的饲料厂来说，工作量较大，检测成本较高。本研究旨在探索一种方法，同时检测以上三种脂溶性维生素的含量，为饲料企业快速、高效检测提供良好方法。

2 材料和方法

2.1 试剂和材料

甲醇（色谱级）（默克公司）、维生素A 乙酸酯标准品（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）、VD标准品（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）、VE乙酸酯标准品（Fluka 公司）、0.45μm 有机系微孔过滤器、100mL棕色容量瓶等。

2.2 主要仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪配紫外检测器、高速混匀器、恒温水浴锅、超声波清洗仪、超纯水仪、分析天平等。

2.3 样品前处理

称取试样1g，精确至0.0001g，置于100mL 棕色容量瓶中，加60mL 甲醇涡旋，转移至水浴锅，60℃15min，盖子不要太紧，冷却，超声30min，冷却定容，过0.45μm 有机系微孔过滤器到进样瓶中，待检。

2.4 标准溶液配制

准确称取标准品VA 乙酸酯0.1000g，VD0.0100g，VE 乙酸酯0.2000g 分别于100mL 棕色容量瓶中，加入30mL 甲醇涡旋，再加30mL 甲醇，摇匀，放入60℃水浴15min，冷却后超声30min，待再次冷却后用甲醇定容，摇匀，即得2,907.00IU/mL VA、4,000.00IU/mL VD、2.00IU/mL VE 标准储备液，置于-18℃冰箱避光保存，有效期6 个月。用甲醇逐级稀释成VA 乙酸酯11.63、58.14、116.28、290.70、581.40IU/mL；VD16.00、80.00、160.00、400.00、800.00IU/mL；VE 乙酸 酯0.008、0.040、0.080、0.200、0.400IU/mL的系列混合标准溶液。

2.5 色谱条件

色谱柱：Kromasil C色谱柱（规格：150×4.6mm，粒度5μm）；流动相：甲醇；流速：1.0mL/min；紫外检测器波长：285nm；柱温40℃；进样量：20μL。

3 结果与分析

3.1 测定图谱

检测图谱峰形好，保留时间稳定，标准样品色谱测定图谱见图1、加标样品见图2、待检样品见图3。

图1 标准样品图谱

图2 加标样品图谱

图3 待检样品图谱

3.2 线性关系、检出限和定量限

配制好的标准系列溶液，按2.5 色谱条件进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。结果表明，VA 线性关系良好，线性方程为y=15.42414x+38.18668，相关系数（r）为0.99989；VD线性关系良好，线性方程为y=0.693718x+1.04216，相关系数（r）为0.99997；VE 线性关系良好，线性方程为y=4.64979x+4.82632，相关系数（r）为0.99998。以基线噪声3 倍的峰面积相应的样品检出浓度作为检出限，以10 倍的峰面积相应的样品检出浓度作为定量限，测得3 种维生素的检出限和定量限，即VA 检出限为1.0×10IU/kg、定量限为3.3× 10IU/kg；VD检出限为1.5× 10IU/kg、定量限为5× 10IU/kg；VE 检出限为6IU/kg、定量限为20IU/kg。

3.3 精密度和回收率

取两份不同的空白预混合饲料样品，称取1g，精确至0.0001g，分别添加适量的VA、VD和VE 的标准储备液溶液，制得三个添加水平的样品，简称加标1 和加标2，按照2.3 方法处理加标样品，每个添加重复5 次，然后分别上机测定。随机选取维生素预混合饲料6 份：样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6，进行平行性测定，分别做5 次平行。检测结果见表1，其相对标准偏差均小于10%，说明检测方法的精密度较好。测定结果显示，加标1回收率VA 为94.69%～97.40%、VD为95.67%～98.91%、VE 为95.32%～97.28%，加标2 回收率VA 为96.77%～98.38%、VD为94.93%～98.04%、VE 为94.39%～96.45%%，说明方法准确性较好。

表1 待检样品测定结果

表2 回收率试验结果

4 结论

本文探索了一种能同时、快速检测预混合饲料中VA、VD和VE 含量的检测方法。与GB/T 17817—2010、GB/T 17818—2010、GB/T 17812—2008 相比，可以一次前处理、一次上机同时检测三种脂溶性维生素的含量，节省了时间和试剂成本。该方法前处理操作简单，流动相成分仅一种，步骤少、方便快捷；检测结果精密度高、准确度好。该方法准确、简便、高效，为实验室繁重检验任务提供良好的参考。