复方中草药对猪附红细胞体病的体外药效研究

2022-09-23于水

中国动物保健 2022年8期

于水

（抚顺市农业综合行政执法队辽宁抚顺 113000）

1 附红细胞体病

附红细胞体病是附红细胞体在动物血液中附着在红细胞的表面或游离在血浆中，引起的一种人兽共患的传染病。这种疾病在现在的世界环境都处处可见。近年来，人们通常使用广谱抗生素来进行猪附红细胞体病的防治，但治疗效果并不佳，并具有一定的毒副作用，对广大生猪养殖户的经济利益造成严重损失。考虑到西药的副作用，本次研究的就是相对安全的中草药，因为中草药对身体伤害小，人体吸收后会排出，即使残留在身体里的药物也基本没有毒副作用。所以现在中草药对防止和控制疾病的感染等状况起到了很大的作用。

1.1 附红细胞体病的致病机理

附红细胞体病是由红细胞凝集素作为媒介导致机体产生的溶血性贫血，或者由自身免疫力拮抗导致的自身免疫性引起的溶血性贫血，该病在急性发病期的贫血机制尚不完全清楚。近年来的研究发现，附红细胞体会影响动物体的免疫功能，免疫功能的降低可以继发其他多种疾病的感染。由附红细胞体感染的动物，其临床特征有时无明显变化，感染后导致的免疫力下降，或在应激状态下，感染率会上升，当感染程度达到一定量时，会造成附红细胞体感染。被附红细胞体感染后，在显微镜下可以观察到细胞膜表面有很多突起，细胞膜的韧性就会变低，容易破碎，就会使隐蔽的抗原发生变化，导致被自身的免疫系统攻击。

1.2 附红细胞体病的临床症状

高热、贫血、黄疽等症状是猪附红细胞体的主要临床症状，当然对于不同的动物症状也有所不同。猪感染以后会在3～20d 发病，大概一周左右较为常见，有些报道说“时间短则几天长则几年，重症者导致死亡”。附红细胞体可以感染任何阶段的猪，症状也有所不同，不过都会有些影响。最容易感染该病的是断奶仔猪，阉割后几周的仔猪极易感染。仔猪一般感染该病后发病很急，体温迅速升高，最高可达到42℃；精神萎靡不振，食欲也随之下降，严重导致食欲废绝；另外呼吸系统也受影响，出现呼吸困难的现象；有的会出现黄疽；免疫系统机能下降，可见淋巴结肿大等症状。

1.3 附红细胞体病的病理变化

附红细胞体病的家畜通常出现发病发热症状，在病畜身上采集血液，采集的血液表面会有一层血膜，血膜上会有明显的凝血现象出现，观察血液的颜色，如果血液偏暗，就说明该病可以引起动物贫血。这时可以测出血液中的血糖、血红蛋白等变少，胆红素葡萄糖梭基转移酶的浓度也会马上上升。把一头死于急性病的猪进行剖检，可以观察到血液不是正常的黏稠状，很稀薄，长时间放置没有凝血现象或者血液凝固比正常时间长，皮肤和薄膜会出现发白的情况，严重的会出现黄染，淋巴结有不同程度的肿胀，肌肉胶样浸润；肝脏和脾脏质地变松软并且肿大。心脏外膜肉眼可见一些有小的出血点。脂肪也会出现黄染的情况，但是不明显。肺水肿，肾脏也会有明显的肿胀，而且变脆，皮、髓质边界不明显，可以看到边界有出血点；结肠、直肠薄膜上有溃疡，如绿豆大小。骨髓液和脑脊液量增多。

2 材料与方法

2.1 材料

1）试验药材。药材常山购买于亳州市真源堂药业有限公司，骆驼蓬子、狼毒均购买于河北安国市冷背药材有限公司。

2）主要试剂。化学分析纯盐酸，无水乙醇，氯仿，氨水，均来自辽东学院农学院。

3）试验仪器。主要仪器包括恒温水浴锅（HH-S1），旋转蒸发仪（RE-52），光学显微镜（CW0980T），电热恒温干燥箱（DHG202-0A）等。

4）猪附红细胞体的阳性血液。从猪场选取有附红细胞体传染病症状的猪20 头，例如病畜会有典型贫血、黄疸等症状出现，在病畜颈部取血20 份，每份约2mL，并在血液中加入抗凝血剂，以防止血凝。

2.2 方法

1）猪附红细胞体阳性血液的检验与判断方法。制备阳性血液涂片20 份，通过直接血液涂片镜检的方法，确认是否感染附红细胞体，如果在镜下有连续三个视野均发现有附红细胞体感染的红细胞，则判定该样品为附红细胞体阳性，并通过以上三个视野的阳性红细胞计数计算感染率。公式如下：感染率=∑每个视野的阳性红细胞数量/（200× 3）× 100%。

2）药物提取物的制备。分别准确称出骆驼篷子、狼毒、常山三种中草药各50g，把骆驼篷子加入750mL 的85%的酒精中，再放于水浴锅中进行蒸馏，共蒸馏三次，提取水浴锅中蒸馏的产物；取骆驼蓬子50g，加入750mL 的85%乙醇，置于70℃恒温水浴锅中，蒸馏三次，取其提取物，并与乙醇合并，在一边放置12h，之后进行过滤，收集烘干物。常山50g 也放进水浴锅中提取3 次，每次用200mL 的乙醇之后过滤，收集烘干物质。把狼毒50g 放入水浴锅中蒸馏，之后过滤收集干物质。将以上三种过滤后的干物质收集，分别研磨成粉末。

3）体外药敏实验。将以上实验所提取的骆驼蓬子、狼毒、常山、三种药物的粉末，分别把它们配成4、2、1 和0.5mg/mL 的溶液，进行以下药敏试验。

然后取载玻片16 块，分为4 组，每组分4 块，A 组三块的载玻片上放入猪附红细胞的阳性血液，附红细胞的阳性血液必须是在80%以上20μL，之后加入上面配置好的高中低四个剂量的骆驼孟子提取液，然后依次滴加以上配好的骆驼蓬子提取物药液20μL，就是A 组的第一个加4mg/mL、第二个加2mg/mL、第三个加1mg/mL、第四个加0.5mg/mL，观察其药物不同浓度对附红细胞的影响。B 组加入狼山的高中低四个浓度的溶液。C 组与以上骆驼篷子和狼山一样。让其混合后分别为常山和狼毒提取物药液，滴加方法和用量与第一组相同。均匀混合后立刻放在油镜下观察红细胞的状态，观察红细胞表面是否附着在附红体，从而判断附红细胞是否对此药物敏感。D 组为对照组，不添加任何药物，只加入0.9%的生理盐水，以及感染率在80%以上的附红细胞溶液。

3 结果与分析

3.1 猪附红细胞体的阳性血液的观察结果

1）由血滴片所判定出的结果是红细胞没有原来的立体规则形状，变成现在的细胞边缘不整齐，出现星芒或不规则的多边形形状。

2）血涂片判定出结果是红细胞没有原来立体的规则形状，变成现在的细胞边缘不整齐，甚至出现星芒状或者是不规则的多边形状等。附红体在红细胞膜表面上多是单个的或者成团的存在，在油镜下慢慢晃动载玻片，可以发现附红体有一点折光度。在显微镜下观察到红细胞被感染的状态，经计算，感染率在80%以上的血涂片有九份，感染率在65%左右的有三份，感染率在20%的有两份，血涂片全部感染，因此判断出为阳性。

3）PCR 方法所判定出的结果也是阳性的，结果与前面两种方法镜检结果相同。

3.2 体外药敏的实验结果

如表1 所示，通过药敏实验结果可以看出，不同剂量组的骆驼篷子、常山、狼毒这三种药物的混合提取物，对附红细胞体的作用也有所不同。而在下面几组中看见，在高剂量的中草药加入1min后，在显微镜下就可以看见附红细胞从红细胞的表面脱落；2min可见从红细胞上脱落的附红细胞体失去活性，不摆动；5min 后可以观察到红细胞恢复正常状态，在同一视野计算附红细胞体感染率为零。在中剂量的中草药加入后5min，在显微镜下看见大部分的红细胞都已经恢复正常状态，但还有一些红细胞上还附着附红细胞，在同一镜下计算红细胞的感染几率为15%～30%。